Čiščenje in karakterizacija gama poliglutaminske kisline iz bakterije Bacillus licheniformis NRC20

Uvod

Gama poliglutaminska ksilina (γ-PGA) je polimerna aminokislina, ki jo proizvajajo nekateri sevi Bacillus licheniformis. Gre za nenavaden anionski polipeptid v katerem D- in/ali L- aminokislinske enote polimerizirajo preko γ-amidne vezi med α-amino in γ-karboksilno skupino naslednjega aminokislinskega ostanka. Karboksilne stranske verige lahko kemijsko modificiramo in tako vstavimo različne bioaktivne ligande ali reguliramo funkcijo polimera. Posebnost γ-PGA je v tem, da težje pride do encimske degradacije, saj proteaze, ki se jih najpogosteje uporablja, težko prepoznajo γ-povezane glutaminske kisline. Dokazali so tudi, da je γ-PGA slab imunogen, najverjetneje zaradi svoje preproste homopolimerne strukture, podobne polisaharidom. γ-PGA ni kemično sintetiziran polimer, je varen, popolnoma biorazgradljiv ter ni toksičen za človeka. Študije so pokazale, da γ-PGA pomaga pri absorpciji kalcija v črevesju, ojača imuno-stimulativno aktivnost in izboljša antitumorsko aktivnost. Poznamo različne možnosti uporabe γ-PGA: hidrogeli z veliko sposobnostjo absorpcije vode, krioprotektanti, aditiv v hrani, faktor, ki preprečuje osteoporozo, dostava zdravil, material za imobilizacijo encimov, čiščenje odpadnih vod,... Raziskave so pokazale, da prosta karboskilna skupina v vsaki enoti predstavlja možnost za vezavo nekega zdravila. γ-PGA zato spada med kandidate za selektivno dostavo kemoterapevtskih agensov.

Namen raziskave

Namen raziskave je izolacija in karakterizacija nove bakterije, ki producira γ-PGA, optimizacija pogojev za visoko produkcijo γ-PGA in karakterizacija očiščenega polimera.

Potek dela in rezultati

Izbrali so 25 bakterijskih izolatov, ki so jih predhodno dali v vodno kopel na 80°C za 10 minut. S tem so odstranili vegetativne celice in pa bakterije, ki ne tvorijo spor. Ugotovili so, da 7 od 25 izbranih sevov izloča polimer γ-PGA. Najbolj uspešen pri produkciji γ-PGA je bil izolat NRC20, ki so ga izolirali iz tal v rudniku. Na plošči je zrasla zelo sluzasta kolonija, v tekočem mediju pa so izmerili zelo visoko viskoznost. Na podlagi očiščenega γ-PGA so izdelali standardno krivuljo med koncentracijo γ-PGA in relativno viskoznostjo. Zaradi dobrih rezultatov so se odločili izolat NRC20 podrobneje preučiti. Na podlagi analize 16s RNA so ugotovili, da sev spada v rod Bacillus licheniformis. Naslednji korak je bil optimizacija pogojev za produkcijo γ-PGA. Ugotovili so, da Bacillus licheniformis NRC20 za rast in produkcijo γ-PGA ne potrebuje L-glutaminske kisline, vendar pa se je v njeni prisotnosti produkcija γ-PGA močno povečala. Med seboj so primerjali pet različnih medijev in ugotovili, da je viskoznost najvišja ob uporabi bazalnega medija (vsebuje vodo, različne soli potrebne za rast bakterij, vir ogljika in vir dušika), zato so ta medij tudi uporabili kot izhodišče za nadaljno optimizacijo. Nato so spremljali rast in produkcijo γ-PGA glede na vir ogljika in vir dušika, ki so ga uporabili. Izkazalo se je, da je tako rast, kot produkcija γ-PGA najboljša v mediju, ki ima kot edini vir ogljika glukozo, najboljši vir dušika pa je L-glutaminska kislina. Potrebno je bilo še optimizirati temperaturo, pH in čas inkubacije. Rast je bila najboljša pri 30°C, pH 7 in inkubacijskem času 7 dni. Vendar pa produkcija γ-PGA ni bila najvišja pri optimalnih pogojih za rast, temveč pri 35°C, pH 7-7,5 in inkubacijskem času 4-5 dni. Sledilo je čiščenje in karakterizacija γ-PGA. Bacillus licheniformis NRC20 izloča γ-PGA izven celic, tako da je čiščenje enostaven proces, ki poteka v treh stopnjah. Najprej so s centrifugiranjem odstranili bakterijske celice, nato so z etanolom oborili polimer ter na koncu še dializo odstranili nečistoče z nizko molekulsko maso. Za karakterizacijo aminokislin v γ-PGA so uporabili tankoplastno kromatografijo. Rezultat sta bili dve lisi, ki ustrezata L-glutaminski kislini in D-glutaminski kislini, in sicer v razmerju 65:35. Da bi se prepričali ali gre res za γ-PGA so polimer analizirali še z LC-ESI MS. S to metodo so dokazali prisotnost ponavljajoče se strukture, sestavljene iz enakih enot z molekulsko maso 148,1 Da, kar ustreza velikosti glutaminske kisline. Polimeri so bili različnih dolžin, vendar so bili vsi sestavljeni izključno iz glutaminske kisline.

Zaključek

Zaključimo lahko, da je sev Bacillus licheniformis NRC20, izoliran iz tal v rudniku, obetajoč sev za visoko učinkovito produkcijo γ-PGA, ki ima zelo širok spekter uporabe. Uporablja se za dostavo zdravil, čiščenje odpadnih vod, kot krioprotektant ter za proizvodnjo nanodelcev, ki se uporabljajo v tkivnem inženirstvu ter za uspešno dostavo kemoterapevtskih agensov pri zdravljenju raka.

Viri

Tork, Sanaa E., Magda M. Aly, Saleha Y. Alakilli, and Madeha N. Al-Seeni. 2015. “Purification and Characterization of Gamma Poly Glutamic Acid from Newly Bacillus Licheniformis NRC20.” International Journal of Biological Macromolecules 74. Elsevier B.V.: 382–91. doi:10.1016/j.ijbiomac.2014.12.017.