11.Pomen RNAi kot obramba pred virusi in transpozoni

Gostiteljska celica je za obrambo pred virusi in transpozoni (deli DNA, ki se prenašajo z enega mesta na drugo mesto istega genoma) razvila mehanizme za uničenje tujega genskega materiala in utišanje ponavljajočih sekvenc. Eden pomembnejših mehanizmov za takšno regulacijo in primarno obrambo je RNAi (interferenčna RNA) pot. RNAi varuje celico pred virusi na način, da razgradi virusno RNA. Poleg gostiteljske celice, imajo tudi virusi sposobnost uporabe RNAi. Posledica slednjega je sposobnost, da lahko virus spremeni ekspresijo genov gostiteljski celici in obratno. Virusi izkoriščajo RNAi tudi za blokiranje gostiteljevih mehanizmov rezistence. Gostiteljske celice za utišanje genov kodirajo miRNA, katerih funkcija je diferenciacija in razvoj celice ter obramba pred virusi in transpozoni. Ekspresija te vrste RNA je tkivno specifična in se spremeni v primeru bolezni, kot je rak. Molekule miRNA delujejo kot komponente kompleksov, ki so zgrajeni iz ribonukleotidov in proteinov ter regulirajo ekspresijo genov preko interakcij s tarčno RNA. Tarčni geni so običajno geni, ki so povezani z diferenciacijo in razvojem celice. Tarča za miRNA so tudi virusne sekvence, zato napaka v regulaciji ekspresije te vrste RNA vodi do bolezni. Virusi so kot odziv nanje razvili veliko število adaptacij, s katerimi zatrejo in se izognejo gostiteljski miRNA. Nekateri virusni genomi so namreč sposobni kodiranja miRNA, ki interferira z gostiteljskim genomom. RNAi varuje celico pred transopzoni z degradacijo transkriptov transpozonov in na način, da preko formacije heterokromatina prepreči ekspresijo transpozonskih elementov. Utišanje genov kot obramba pred virusi in transpozoni poteka s post-transkripcijskimi in s transkripcijskimi mehanizmi. Post-transkripcijski mehanizem se začne s cepitvijo dsRNA do siRNA, ki se vključijo v kompleks RISC. Kompleks RISC je velik kompleks, sestavljen iz ribonukleotidov in proteinov. Glavna naloga kompleksa je cepitev tarčne RNA. V rastlinah je siRNA vrsta RNA, ki skrbi za obrambo pred virusi in transpozoni. Molekule siRNA delujejo kot matrice, ki prepoznajo specifično zaporedje na mRNA, družina ribonukleaz in Dicer pa izvedejo cepitev verige mRNA. Majhne RNA molekule ne delujejo le post-transkripcijsko, ampak vplivajo tudi na transkripcijo DNA. Delujejo namreč na določene sekvence na kromatinu in ga pretvorijo v heterokromatin, ki predstavlja nekodirajočo obliko kromatina. Gostiteljske RNAi molekule so se preko evolucije hitro razvijale skupaj z virusnimi RNAi molekulami. Gre namreč za koevolucijo med gostiteljskimi celicami in njihovimi paraziti. Raziskave kažejo, da je imel skupni prednik vseh evkariontov funkcionalno RNAi pot, kar pomeni, da gre za starodaven, dobro ohranjen in posledično učinkovit mehanizem obrambe.

RNAi kot obramba pred virusi

RNAi služi kot zaščita pred virusi, saj degredira virusno RNA, vendar to ni njena edina naloga. Gostitelji in virusi lahko uporabijo RNAi za manipulacijo genske ekspresije eden drugega, poleg tega pa lahko gostitelj uporabi svojo miRNA, da napade virusno sekvenco. Zaradi te lastnosti so virusi izumili vrsto različnih adaptacij, ki zavrejo RNAi ali pa se RNAi preprosto izogibajo. Rastlinski kot tudi živalski virusi kodirajo proteine, ki inhibirajo RNAi. Poznamo različne RNAi mehanizme, ki posredujejo gostitelj-parazit reakcije. Ti mehanizmi so viRNA, miRNA, piRNA in endorgena siRNA pot. Opisala pa vam bom le viRNA pot.

viRNA pot

Spada med direktno obrambo proti virusom, s pomočjo RNAi. Poleg tega spada med pomembno komponento prirojene antivirusne imunosti pri rastlinah, glivah in drugih živalih.

Virusno dsRNA prepozna dicer in jo zreže na 21-24 dolge nukleotidne fragmente, ki se imenujejo siRNA v splošnem, vendar v našem primeru so to viRNA. Ti se nato naložijo na agronavtsko efektorni kompleks(RISC). Ena veriga se razreže in razpade, druga pa ostane v kompleksu. Aktiven agronavtski kompleks se veže na mRNA, in sicer na tisti del mRNA, ki ima komplementarno sekvenco viRNA, ter razreže viRNA. Ta pot je prisotna pri vseh živih organizmih. Nekateri evkarionti pa so sposobni zaustavitve širjenja viRNA s pomočjo gostiteljsko kodirane od RNA odvisne RNA-polimeraze(RdRp), ki širi antivirusni obrambni signal do drugih celic.

Virusno inhibiranje in izogibanje viRNA poti

Veliko virusov inhibira viRNA pot s pomočjo virusnih supresorjev(VSR). Prva virusna supresorja identificirana pri rastlinskih virusih sta bila Hc-Pro protein(potyvirus) in 2b protein(cucumovirus). Medtem, ko je bil prvi VSR pri živalskih virusih B2 protein, najden v FHV virusu. Virusni supresorji so pri virusih postali tako pomembni inhibitorji viRNA poti, da nekateri virusi kodirajo celo več kot en virusni supresor. Primeri teh so closterovirus, ki kodira tri in različni potyvirusi, ki kodirajo dva. Pomembno je še to, da je večina VSRjev vezavnih proteinov dsRNA. Naloga večine virusnih supresorjev je, da izolirajo viRNA molekule in jih premaknejo stran od RNAi poti, vendar obstajajo tudi drugi mehanizmi. Poleg tega je znano, da niso vsi VSRji proteini, ampak so molekule RNA. Naloga teh je, da vežejo RNAi komponente namesto viRNA. Ker poznamo različne vrste virusnih supresorjev je smiselno, da tudi ti napadejo različne komponente RNAi. Kot na primer Hc-Pro in B2 inhibirata viRNA pot z napadom na dicer, medtem, ko 2b protein napade agronavtski kompleks. Virusi zmanjšajo učinek RNAi, tako da preprečijo stik dsRNA z RNAi potjo ali pa da prepreči razpad sintetizirane viRNA. Lahko se zavarujejo tudi na drugačen način in sicer, da zmanjšajo sintezo dsRNA in s tem ščitijo virusni genom pred razpadom. Pomembno je tudi to, da so določene regije virusnega genoma bolj občutljive kot druge. O vsem tem pa odloča sekundarna struktura virusne RNA.

miRNA pot in gostiteljsko-virusne interakcije

Gostiteljske kot tudi virusne sekvence se lahko spremenijo v miRNA, katere pot je lahko antivirusna ali pa jo virusi izkoristijo v svojo korist.

Virusno kodirana miRNA

Prvič je bila odkrita v Epstein-Barr virusu, kasneje pa so jo odkrili še pri treh herpes virusih, polioma virusih in retrovirusih. Virusi uporabljajo miRNA pot, da nadzirajo njihovo gensko ekspresijo, kar virusu omogoča, da se izogne gostiteljskem imunskem odzivu. Zagotovo pa lahko rečemo, da je ta značilnost prisotna le pri dsRNA virusih.

Gostiteljsko kodirano miRNA

Gostitelji uporabljajo miRNA pot kot obrambo proti virusom s pomočjo ekspresije take miRNA, ki napade virusno RNA. Na primer PFV-1 virusna mRNA je tarča človeške miRNA(mir-32), saj znižuje replikacijo PFV-1. Znano je tudi, da je gostiteljska miRNA efektor pri prirojenem imunskem odzivu vretenčarjev. Virusi lahko izkoristijo gostiteljsko kodirano miRNA za njihovo korist, kar so do sedaj odkrili pri hepatitis C virusu.

Transpozoni in piRNA

Transpozoni so DNA fragmenti, ki se prenašajo iz enega dela na drug del istega genoma. Njihova aktivnost predstavlja grožnjo gostitelju, saj se lahko vstavijo v nek funkcionalni gen in ga tako onesposobijo. Tako so transpozoni spodbudili razvoj kontrolnih mehanizmov, ki ščitijo genom.

Transpozoni so pri ljudeh prisotni skoraj v polovici genoma. Ločimo jih na dva razreda, in sicer glede na struktro in način premikanja. Elementi 2. razreda so sestavljeni iz DNA transpozonov in jih je manj kot 3%. Razred 1 pa so retrotranspozoni, ki zavzemajo skoraj polovico genoma sesalcev.

V enem genomu je lahko več vrst retrotranspozonov. Njihovo število in stopnja aktivnosti odraža uspeh v preživetju v gostitelju skozi evolucijo. Retrotranspozone lahko razdelimo v dve skupini. Prvo skupino redstavljajo retrotranspozoni, ki imajo dolgo terminalno zaporedje (LTR-retrotranspozoni). Te transpozoni naj bi bili ostanki infektivnih retrovirusov, ki so postali genomsko zaporedje. Te transpozoni proizvajajo Pol in Gag proteina, ki omogočata reverzno transkripcijo njihovega RNA v citoplazmi, še preden se preselijo na novo lokacijo. Vendar pa pri človeških LTR-retrotranspozonih ni bilo opažene nobene aktivnosti, medtem, ko pri miših povročajo škodljive mutacije. Druga skupina retrotranspozonov pa so retrotranspozoni, ki nimajo dolgega terminalnega zaporedja. Poznamo dve vrsti non-LTR retrotranspozonov. Imenujemo jih LINE in SINE.

Transpozoni se množijo po genomu in lahko škodujejo gostitelju, če povzročijo mutacije. RNAi lahko služi kot obramba proti transpozonom z uničevanjem transkriptov. V mnogih organizmih je za to nalogo odgovorna piRNA. PiRNA je majhna RNA, ki je dolga le 25-30 nukleotidov. Ta RNA nastane iz dolgih prekurzorjev neodvisno od DROSH-e ali DICER-ja. Pi-RNA je povezana z Piwi proteini, ki spadajo med proteine Argonaute. PiRNA skupaj z Piwi proteini je bistvena pri razvoju zarodnih celic. Mišji genom kodira tri Piwi proteine, med njimi MILI in MIWI2, ki igrata vlogo v obrambi gostitelja. Pri sesalcih ima metiliranje DNA veliko vlogo pri obrambi. Metilirajo se citozini, ki se v večini nahajajo v transpozonih. Metiliranje DNA povzroči takojšno transkripcijsko zaviranje transpozonov.

Retrotranskripti nastanejo iz transpozonov znotraj jedra. Retrotranskripti so v genomu orientirani obratno, se pravi obstajajo smerni in protismerni retrotranskripti. Zaznajo Piwi proteini in retrotranskripti se razcepijo v smerne in protismerne piRNA. Ti dve obliki piRNA se nahajata v citoplazmi, in sicer v posebnih razdelkih. Kot sem že omenila se piRNA veže z Piwi proteini. Smerna piRNA se večinoma veže z MILI proteini, ki so podprti z TDRD1 Tudor proteini, nahaja pa se v specifičnem organelih, ki jih imenujemo "pi-bodies". Protismerna piRNA pa se povezuje z MIWI2 proteini, kateri so povezani z TDRD9 Tudor proteini. Nahajajo se v organelih imenovanih "piP-bodies". Izmenjava smerne in protismerne piRNA med obema vrstama organelov ojača in pospeši degredacijo transkriptov transpozonov. MIWI2-TDRD9 kompleks in protismerna piRNA gredo lahko v jedro, kjer spodbudijo transkripcijsko represijo. To storijo s pomočjo Dnmt3L in Dnmt3A, ki sta metiltransferazi. Tako se transpozon metilira.

Viri

1.Buchon N. et al. RNAi: a defensive RNA-silencing against viruses and transposable elements. Heredity , 2006, 96, 195-202.

2.Obbard D. J. et al. The evolution of RNAi as a defence against viruses and transposable elements. Philosophical Transactions of The Royal Society B, 2009, 364, 99-115.

3.Großhans H. et al. The expanding world of small RNAs. Nature, 2008, 451, 414-416.

4.Takeda T. et al. A plant RNA virus suppresses RNA silencing through viral RNA replication. The EMBRO Journal, 2005, 24, 3147-3157.

5.Zamudio N. et al. Transposable elements in the mammalian germline: a comfortable niche or a deadly trap?. Heredity, 2010, 105, 92-104.