ALiVE – analiza živih celic z vezikularnim izvozom

Spletna stran projekta ALiVE, iGEM 2019, https://2019.igem.org/Team:Munich

Skupina iz Municha je na tekmovanju iGEM leta 2019 razvila študentski projekt z naslovom ALiVE. Cilj projekta je bil razviti diagnostično orodje, ki je minimalno invazivno in omogoča spremljanje transplantiranih celic skozi čas s pomočjo vezikularnega izvoza transkriptomov.

Avtorica povzetka: Sara Korošec

ALiVE kot diagnostično orodje za beta celično terapijo

Bolniki z diabetesom tipa I si morajo administrirati insulin večkrat dnevno. Z namenom odpravljanja takšne invazivne terapije, razvoj stremi k transplantaciji beta celic. Tudi splošno gledano, je diagnostika na področju spremljanja celic po transplantaciji precej v zaostanku. Skupina je ocenjevala delovanje diagnostičnega orodja ALiVE v sodelovanju s strokovnjaki s tega področja. Zamislili so si aplikacijo na dveh področjih:

- spremljanje diferenciacije terapevtskih celic

- kot diagnostično orodje za spremljanje celičnih transplantantov na neinvaziven način.

Načrt projekta

ALiVE predstavlja diagnostično orodje, ki omogoča analizo živih celic s pomočjo vezikularnega eksporta. Celoten postopek so razdelili na pet segmentov:

- Kodirana informacija. Stanje celice je zelo odvisno od njenega proteoma. Posledično bi bila najbolj očitna možnost izolacija proteinov in nadaljnja analiza. Ekipa je označila karakterizacijo proteinov kot preveč kompleksno, zato so se odločili za mRNA. Slednja neposredno poda informacije o genih, ki se izražajo, z novodobnim sekvenciranjem je omogočena še zelo natančna analiza.

- Nalaganje v vezikle. Pri vnosu RNA v vezikle so uporabili RNA-vezavne proteine. Ekipa jih je označila kot RNA-adapterji.

- Izločanje veziklov Vezikli so narejeni tako, da zavarujejo vsebino, saj je RNA dokaj nestabilna molekula. Testirali so več različnih veziklov glede na sposobnost tvorjenja delcev, nalaganja tovora, učinkovitosti, možnost izolacije in celične toksičnosti. Odločili so se za eksosome in virusom podobne delce.

- Izolacija veziklov. Potrebno je razlikovati med vezikli, ki jih želimo izolirati in med ostalimi vezikli, ki so prisotni in so enake velikosti.

- Analiza podatkov

Ideja

Ekipa je želela pridobiti informacije iz celice, brez potrebe po lizi. Torej, ideja sloni na biomolekuli, ki ima kodirano informacijo in je sposobna izvoza iz celice. Odločili so se za RNA, saj le-ta zadosti njihovim pogojem. Nekatera zaporedja RNA tvorijo sekundarne strukture, prav tako poznamo RNA-vezavne proteine, ki imajo visoko afiniteto za vezavo na RNA. Slednje lastnosti so izkoristili, za preusmeritev RNA iz citosola do celične membrane preko RNA-vezavnih proteinov, ki so vezani na membranske proteine. Uporabili so L7Ae, ki je protein iz Archaeoglobus fulgidus in je RNA-vezavni protein in interagira z RNA motivom C/D-box. Tak sistem se je že uporabil za dostavo terapevtskih mRNA v eksosomih iz ene celice v drugo. Drugi RNA-vezavni protein, ki so ga uporabili je plaščni protein bakteriofaga MS2 (MCP). Slednji interagira z motivom lasnične zanke v fagnem genomu. RNA so precej nestabilne molekule, njihova razpolovna doba se zelo razlikuje. Želeli so razviti zaščitne vezikle, ki kontinuirano transportirajo RNA. Kot prvo možnost, so razvili vezikle, ki so podobni endogenim eksosomom, ki sodelujejo pri medcelični komunikaciji in regulaciji imunskega sistema. Naredili so fuzijo RNA-vezavnih proteinov na CD63, ki je eksosomalni marker (2). Na tak način se bo RNA pogosteje pojavila v eksosomih in izločila s pomočjo eksocitoze. Na CD63 so vezali še 6xHis-tag, ki je orientiran na zunanjo stran eksosoma in s tem olajša kasnejšo izolacijo, ki bi jo izvedli z nikelj afinitetno kromatografijo. Dodatek luciferaze kot reporterskega gena, omogoči kvantifikacijo sistema.

Razvili so še drugo možnost, ki vključuje virusom podobne delce (VLP). Slednji se lahko izločijo iz človeških celic ob prisotnosti antigena specifičnega za HIV skupine (GAG). GAG je neškodljiv, saj tvori izključno virusni matriks, kapsido in nukleokapsido. Na GAG so vezali RNA-vezavne proteine. Celokupno, so na tak način v VLP vezali več RNA-vezavnih proteinov kakor v prej opisane eksosome. Za izolacijo virusom podobnih delcev so predlagali heparin afinitetno kromatografijo.

Za lažje sestavljanje posameznih delov so v sistem vključili ovite vijačnice. Naredili so del, ki je vseboval CD63 oziroma GAG in HiBiT ter alfa vijačnico P9SN. Drug del so sestavili iz alfa vijačnice P10SN in RNA-vezavnega proteina. Vsako alfa vijačnico sestavlja 32 aa. Medsebojno lahko interagirata z elektrostatskimi interakcijami v paralelni orientaciji. Naredili so še drug set iz DHD154a in DHD154b kjer vsaka domena sestoji iz dveh alfa vijačnic, torej ob dimerizaciji tvorita tetramer.

Biokocka BBA_K3113051

V sklopu tekmovanja je ekipa naredila konstrukt CD63-6xHis, z namenom lažje izolacije eksosomov z afinitetno kromatografijo. Eksosomalni marker CD63 ima zgradbo štirih transmembranskih alfa vijačnic z dvema zunajceličnima zankama. Tako N- kot C-konec sta orientirana v notranjost ekososoma, zato so 6xHis-tag oznako vključili v zanko. Natančneje, oznako so vstavili za Ser161.

Rezultati

Sistem HiBiT

V konstruirane delce so vključili Promega Nano-Glo® HiBiT zunajcelični detekcijski sistem. Naredili so fuzijo peptida HiBiT s C-koncem CD63 oziroma GAG. Ob združitvi HiBiT in LgBiT se rekonstruira encim luciferaza, kar omogoča bioluminiscenčni signal ob prisotnosti substrata. Test se opravi 48 do 72 ur po transfekciji in omogoča potrditev tvorbe veziklov ter obstoj zunaj celic.

Učinkovitost izločanja veziklov

Vsak vzorec so razdelili na tri dele i) celična vsebina, ii) supernatant (SN) po lizi, iii) supernatant pred lizo kot je prikazano na sliki. Za lizo so uporabili detergent Triton X-100 in vzorec izpostavili 60 °C 15 minut. Koncentracijo so navedli kot najvišjo možno pri kateri poteče liza, vendar ne tako visoko, da bi vplivala na analizo. Sposobnost izločanja VLP in eksosomov so preverili na celicah HEK293T. HiBiT signal so določili celicam, prav tako tudi ustreznemu supernatantu. Eksperiment so ponovili v petih replikatih. Vključena je bila tudi negativna kontrola. Na grafu A so celice, ki so transficirane s plazmidom z zapisom za VLP z GAG in RNA-vezavnim proteinom (L7Ae) in brez RNA-vezavnega proteina. Graf B prikazuje celice, ki izražajo eksosome brez in z RNA-vezavnim proteinom (L7Ae). Količina izločanih VLP je višja v primerjavi s celicami, ki izločajo eksosome. Transmisijska elektronska mikroskopija (TEM) S TEM so preverjali obliko veziklov kot je prikazano na Sliki 8. Natančen premer pa so določili s pomočjo dinamičnega sipanja svetlobe (DLS). Premeri so se razlikovali glede na tip celic in glede na prisotnost oziroma odsotnost RNA.

qPCR analiza

Za namene analize so najprej izolirali RNA in naredili prepis v cDNA. Dokazati so želeli, da so vezikli sposobni vezati RNA, zato so kvantificirali količino FLuc mRNA, ki je v veziklih v primerjavi s količino FLuc mRNA, ki se nahaja v celici. Dodali so še negativni kontroli brez matrice in brez začetnega oligonukleotida. Predhodno so naredili še kontrolo brez RNA-vezavnih proteinov (L7Ae). Kot referenco so vzeli GAPDH, nato so s pomočjo konfluentnosti celic (70-80%) izračunali še količino FLuc mRNA na celico. Iz rezultatov je razvidno, da so z VLP kot tudi z eksosomi lahko prenesli FLuc mRNA, medtem ko so vezikli brez RNA-vezavnega proteina imeli signifikantno nižjo učinkovitost. Največ FLuc mRNA so vsebovali VLP.

S tehniko ALiVE bi izolirali dovolj velike količine RNA za nadaljnjo analizo transkriptoma, vendar zaradi finančnih omejitev, ekipa tega ni izvedla v sklopu iGEM tekmovanja.

S qPCR so preverjali tudi učinkovitost vezave RNA na RNA-vezavna proteina – L7Ae in MCP. Za vezavo RNA-vezavnih proteinov so se odločili za heterodimerni par P9SN:P10SN, pri čemer je bil P9SN uporabljen za fuzijo na C-konec CD63, medtem ko je bil P10SN vezan na N-konec RNA-vezavnega proteina. Z uporabo L7Ae je bil izvoz trasnkriptomov višji kakor z MCP.

Diagnostično orodje ALiVE je namenjeno uporabi skozi daljši čas, zato so preverili izločanje veziklov iz istih celic v obdobju 72 ur. Kot je prikazano na Sliki 11, je v obdobju 72 ur, izvoz FLuc mRNA uspešen tako s pomočjo eksosomov kot tudi z VLP. Izločanje se po 24 urah ustali in ostane stabilno do 72 ur. Ti rezultati so potrdili, da je analiza celic skozi daljše časovno obdobje možna.

In silico model napovedi učinkovitosti ALiVE

V sodelovanju s prof. dr. med. Gerrit Hohendorf so razvili in silico model za računanje količine dostopne RNA glede na eksperimentalen postopek in različne faktorje, ki vplivajo na celoten izkupiček. V samem procesu lahko zasledimo veliko takšnih faktorjev, in sicer število celic, nivo RNA v celici, afiniteta vezave RNA na RNA-vezavni protein, ipd. S preoblikovanjem enačbe dobimo napoved minimalnega števila celic za merljiv signal.

Zaključek

Diagnostično orodje ALiVE je bilo narejeno z namenom lažjega spremljanja celic po transplantaciji skozi daljše časovno obdobje in na neinvaziven način. Rezultati so pokazali, da so virusom podobni delci boljši kakor eksosomi. Sistem je narejen tako, da omogoča spreminjanje posameznih delov, kar omogoča posamezniku prilagoditev glede na eksperiment.

Viri

1. iGEM 2019 team Munich. ALiVE. https://2019.igem.org/Team:Munich. Dostop: 1.5.2020.

2. Raposo G, Stoorvogel W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 2013, 200(4): 373-383.