Aprifreeze

Aprifreeze je produkt, ki ga je ustvarila študentska skupina z Univerze v Lausanne na tekmovanju iGEM 2021. Uvrstili so se med 10 najboljših ekip podiplomskih skupin študentov.

Spletna stran projekta Aprifreeze, iGEM 2021: https://2021.igem.org/Team:UNILausanne

Avtorica povzetka: Laura Gašperšič

Ozadje problema

Trenuten načina življenja povzroča vse večje podnebne spremembe, ki se na različnih področjih izražajo v različnih oblikah. Vedno bolj pogoste so ekstremne in nepredvidljive temperature, ki vplivajo na številne ekosisteme in posledično na številne dejavnosti in populacije. Pogosto se podnebni vplivi izrazijo pri različnih kmetijskih dejavnostih, ki so močno odvisne od podnebja in temperatur. V Švicarski pokrajini Valais je v zadnjih letih pogosto prišlo do spomladanskih pozeb, po tem ko so rastline že začele cveteti. Te pozebe lahko v veliki meri poškodujejo cvetove in tako zmanjšajo pridelek tudi do 85 %. Študentska skupina iz Švice se je lotila tega problema z uporabo sintezne biologije, kjer so v okviru tekmovanja iGEM pripravili produkt Aprifreeze. Ime izhaja iz marelic, saj je v pokrajini Valais ključna pridelava marelic, sam produkt pa bi lahko uporabili tudi pri številnih drugih rastlinah. Aprifreeze bi proizvajali v obliki raztopine, ki bi jo s stroji pršili po izbranih rastlinah in jih s tem obvarovali pred pozebami [1].

Pri nizkih temperaturah v zunajceličnem prostoru nastajajo in rastejo ledeni kristali, ki lahko vodijo v mehanske poškodbe celičnih sten in membran ali v dehidracijo celic. Zaradi osmotskega ravnotežja namreč pride do prenosa molekul vode v zunajceličnino, to pa povzroči spremembe v celičnem metabolizmu (inaktivacija ali denaturacija proteinov, povečano nastajanje reaktivnih kisikovih spojin) ali v primeru velike dehidracije kolaps membrane in smrt celice [2].

Ideja rešitve problema

Problema pozebe rastlin so se lotili z dvema pristopoma: 1) preprečevanje rasti ledenih kristalov in 2) preprečevanje nastajanja ledenih kristalov z učinkovanjem na patogeno bakterijo Pseudomona syringae. Za prvi del rešitve so pripravili raztopino antifriz proteinov (ang. antifreeze proteins, AFPs). Drugi del rešitve se nanaša na patogeno bakterijo P. syringae, ki na površini izraža ledne nukleacijske proteine (ang. ice nucleation proteins, INPs). S prisotnostjo na rastlini močno poslabša pozebo, saj pospeši tvorbo vodnih kristalov. Za rešitev drugega dela so uporabili dva načina: CRISPR/Cas9 za utišanje gena za INP in uporaba specifičnih proteinskih kompleksov, tailocinov (ang. tailocins), ki ubijejo bakterijo [1].

Izvedba in rezultati

Antifriz proteini za preprečevanje rasti vodnih kristalov

Antifriz proteini (proteini AFP) so naravno prisotni proteini, ki se lahko vežejo na kristale ledu in s tem preprečijo nadaljnjo rast kristalov. Poznanih je več proteinov AFP, ki so različno učinkoviti pri omejevanju tvorbe kristalov [3]. Za pripravo produkta Aprifreeze so preverili tri različne proteine AFP: RiAFP (Rhagium inquisitor APF), DcAFP (Daucus carota AFP) in FflBP (Flavobacterium frigoris PS1 AFP).

Izbrane antifriz proteine so izrazili v E. coli, pri čemer so uporabili dva različna vektorja, pET-17b in pCold-I. Vektor pET-17b vsebuje promotor T7, ki omogoča močno in regulirano izražanje rekombinantnih proteinov, vektor pCold-I pa vsebuje promotor cspA (promotor cold-shock proteina A ), ki omogoča izražanje bolj zahtevnih proteinov, ki jih ne moremo izraziti s T7 sistemom. Z uporabo obeh vektorjev so preverili izražanje posameznega proteina z obema vektorjema ter nato optimizirali izražanje in sintezo proteinov [1].

Za določitev učinkovitosti proteinov AFP so najprej določili termično histerezo uporabljenih proteinov. Proteini AFP v raztopini povzročijo ločitev temperature tališča in temperature zmrzišča. Razlika med vrednostma teh dveh temperatur je definirana kot termična histereza, ki jo lahko eksperimentalno natančno določimo z mikroskopsko analizo raztapljanja oziroma rasti enega ledenega kristala [4]. Za določanje termične histereze je skupina študentov pripravila napravo FROZONE, ki jim je omogočala zelo natančno spreminjanje temperature na bakrovi ploščici. Rezultati so potrdili, da z naraščajočo koncentracijo proteina AFP narašča tudi vrednost termične histereze ter da je RiAFP bolj učinkovit že pri nižjih koncentracijah [1].

Drugi pristop za določanje učinkovitosti je bila analiza poškodb rastlin zaradi pozebe (ang. Frost Damage Treatment, FDT). Za izvedbo le tega so rastlino Arabidopsis thaliana namočili v pufru s prisotnimi proteini AFP in jo preko noči shranili pri -5 °C. Naslednji dan so z uporabo barvila tripansko modrilo analizirali delež mrtvih celic, ki so bile poškodovane zaradi tvorbe ledenih kristalov. Iz deležev poškodovanih celic so lahko ocenili zaščitni vpliv raztopin s prisotnimi proteini AFP. Rezultati so potrdili, da so proteini AFP močno pripomogli k ohranjenosti rastlinskih celic v primerjavi s pufrom PBS brez proteinov AFP. Med različnimi proteini AFP ni bilo signifikantnih razlik [1].

Preprečevanje škode zaradi prisotnosti patogene bakterije P. syringae

Nekatere Gram- bakterije na površini izražajo ledne nukleacijske proteine (proteine INP), s katerimi katalizirajo urejanje vode v obliko ledu in s tem pospešijo nastajanje ledenih kristalov [5]. Prisotnost teh vrst bakterij na rastlinah močno poslabša poškodbe rastlinskih celic ob nizkih temperaturah. Med njih spada tudi P. syringae, prisotna na drevesih marelic, ki s pospešeno tvorbo kristalov povzroči obsežnejše poškodbe rastlinskih celic [1].

Za analizo učinkov, ki jih bakterija P. syringae povzroči pri pozebi, so razvili test, s katerim so merili čas, ki preteče do začetka tvorbe kristalov oziroma test TTF (ang. Time to freeze). Z napravo FROZONE so temperaturo nastavili na -10 °C in merili čas, potreben da kapljice z različnimi sestavami zamrznejo. Ugotovili so, da je ob prisotnosti P. syringae zamrzovanje kapljice zelo pospešeno, čas zamrzovanja pa ni koncentracijsko odvisen od koncentracije P. syringae [1].

Da bi omejili učinke, ki jih povzroča P. syringae, so uporabili dva pristopa:

Tailocini

Tailocini so baktericidni proteini, ki so po strukturi zelo podobni repom bakteriofagov. V naravi jih proizvajajo sevi nekaterih bakterij, med drugim tudi P. syringae syringae, in z njimi delujejo proti sorodnim sevom. S tailocini bakterijski sevi tekmujejo, saj z njimi poškodujejo in ubijejo sorodne seve, medtem ko se produkcijski sev ohrani. Ob vezavi na tarčno bakterijo naluknjajo membrano ter s tem porušijo protonski gradient, posledično pa tarčna celica umre. Njihova visoka specifičnost predstavlja veliko prednost pri uporabi, saj lahko tarčno delujemo le na želen sev in ne vplivamo na ostale (potencialno koristne) seve. Poleg tega lahko dokaj enostavno spreminjamo gene, ki so odgovorni za prepoznavanje celic in s tem prilagajamo uporabnost tudi za nove seve. Prednost je tudi nesposobnost namnoževanja, kar predstavlja manj skrbi kot uporaba fagov. Za laboratorijsko proizvodnjo tailocinov lahko uporabimo reagente, ki povzročijo dvojni prelom DNA, kar inducira njihovo izražanje [1, 6].

Pri študentskem projektu so uporabili sev Pseudomonas syringae pv. aptata DSM50252, ki proizvaja tailocine specifične za P. syringae pv. syringae B301D. V naravnem produkcijskem sevu so inducirali izražanje tailocinov z dodatkom mitomicina C, temu je sledila izolacija tailocinov. Za preverjanje učinkovitosti so uporabili več pristopov: nanos tailocinov na agarne plošče s tarčnim sevom, elektronska mikroskopija, čas zamrzovanja kapljice. Vsi rezultati so dokali, da tailocini učinkovito zmanjšajo število tarčnih bakterij P. syringae, ter da je posledično zamrzovanje raztopine upočasnjeno [1].

Zaradi velikega stroška in toksičnosti pri uporabi mitomicina C so želeli pripraviti konstrukt, s katerim bi izražanje tailocinov iz P. syringae syringae lahko izvedli v bakterijskih celicah E. coli. Zaradi precejšnje velikosti fragmenta, ki zapisuje za tailocin, so le tega pomnožili v 4 korakih (3 kb, 3 kb, 5 kb, 2,5 kb dolgi fragmenti). Po analizi sestavljanja fragmentov so ugotovili, je bilo sestavljanje neuspešno. Za nadaljnje eksperimente jim je zmanjkalo časa, ideja pa je bila, da bi po pripravi genskega konstrukta transformirali celice E. coli, inducirali izražanje z dodatkom IPTG in nato tailocine izolirali iz lizata [1].

CRISPR/Cas9

Drug pristop za preprečevanje učinkov, ki jih povzroči bakterija P. syringae na rastlinah, pa je bila uporaba sistema CRISPR/Cas9 za delecijo gena, ki zapisuje za ledni nukleacijski protein InaZ. Za delecijo gena InaZ so želeli z bakteriofagi v bakterijske celice vnesti fagmid, nato pa bi po principu CRISPR/Cas9 prišlo do delecije gena [1].

Za izvedbo so pripravili tri različne sgRNA, ki ciljajo ločena mesta na genu InaZ. Vse tri konstrukte so ločeno klonirali v vektor ter nato v pripravljene vektorje vnesli še zapis za homologno regijo, ki služi za rekombinantno popravljanje preloma DNA. Od treh pripravljenih zaporedij sgRNA jim je uspelo pripraviti dva vektorja, ki sta poleg zaporedja sgRNA vsebovala tudi homologno regijo. Za preverjanje uspešnosti delecije gena InaZ so z elektroporacijo transformirali celice P. syringae B301D in nato analizirali PCR produkte na agaroznem gelu. Iz velikosti produktov so ugotovili, da pri nobeni od kolonij ni prišlo do delecije in je bil gen InaZ še vedno prisoten. Zaradi pomanjkanja časa jim ni uspelo pripraviti ustreznih postopkov za pripravo fagmidov, s katerimi bi urejali genom [1].

Zaključek

Za preprečevanje škodljivih učinkov spomladanskih pozeb je študentska skupina želela pripravili produkt Aprifreeze, ki bi vseboval antifriz proteine, specifične tailocine za P. syringae in bakteriofage za urejanje genoma P. syringae. Zaradi pomanjkanja časa so natančno preučili in optimizirali postopke le za antifriz proteine in tailocine ter dokazali učinkovitost obeh pristopov. Antifriz proteine in tailocine bi tako lahko uporabili za pripravo razpršila Aprifreeze, potrebne pa bile še dodatne raziskave. Produkt bi poleg dreves marelic lahko uporabili tudi za številne druge rastline.

Literatura

[1] Team UNI Lausane: Aprifreeze https://2021.igem.org/Team:UNILausanne.

[2] M. Bredow, V. K. Walker: Ice-binding proteins in plants. Front. Plant Sci. 2017, 8, str. 1–15.

[3] A. Białkowska, E. Majewska, A. Olczak, A. Twarda‐Clapa: Ice binding proteins: Diverse biological roles and applications in different types of industry. Biomolecules 2020, 10(274).

[4] L. L. C. Olijve, K. Meister, A. L. DeVries, J. G. Duman, S. Guo, H. J. Bakker, I. K. Voetsa: Blocking rapid ice crystal growth through nonbasal plane adsorption of antifreeze proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2016, 113(14), str. 3740–3745.

[5] J. Kassmannhuber, M. Rauscher, L. Schöner, A. Witte, W. Lubitz: Functional display of ice nucleation protein InaZ on the surface of bacterial ghosts. Bioengineered 2017, 8(5), str. 488–500.

[6] S. Carim, A. L. Azadeh, A. E. Kazakov, M. N. Price, P. J. Walian, L. M. Lui, T. N. Nielsen, R. Chakraborty, A. M. Deutschbauer, … A. P. Arkin: Systematic discovery of pseudomonad genetic factors involved in sensitivity to tailocins. ISME J. 2021, 15(8), str. 2289–2305.