Arheje v biotehnologiji

Uvod

Arheje lahko glede na njihovo okoljsko nišo enostavno razdelimo na tri fenotipe: termofile, metanogene in ekstremne halofile. Vsaka skupina ima edinstvene biokemijske lastnosti, ki jih je mogoče uporabiti v biotehnološki industriji. Arheje so na področju industrijske biotehnologije doslej zaostajale za bakterijami in evkarionti. Ti organizmi so naravno sposobni ali jih je mogoče inženirsko spremeniti za proizvodnjo številnih izdelkov, vključno z biogorivi, bioplastiko, površinskimi proteini, lipidi in kemikalijami, potrebnimi za industrijsko sintezo drugih snovi.

Metan

Metanogeni so ena najbolj razširjenih skupin arhej. Njihov energijski metabolizem je izjemno unikaten, saj je neodvisen od molekularnega kisika in pogosto neodvisen tudi od prisotnosti organskih molekul. Kot končni porabniki hlapnih maščobnih kislin, alkoholov ali plinov v anaerobni prehranjevalni verigi proizvajajo močan toplogredni plin - metan. Metanogeni presnavljajo različne substrate, vključno s plini, kot so molekularni vodik, ogljikov monoksid in ogljikov dioksid, ter spojinami, kot so acetat, metanol in metoksilirane spojine. Metanogene arheje so sposobne rasti pri temperaturah od 0 do 122 °C, vendar imajo lahko zelo različne hitrosti rasti, tudi pri isti temperaturi. Večina le-teh uporablja mešanico vodika in ogljikovega dioksida kot substrat, medtem ko nekatere vrste uporabljajo metilne spojine, acetat pa uporablja najmanjši delež metanogenov. Vsi ti substrati so produkti razkroja organskih snovi, zato je metanogeneza običajno zadnja stopnja mineralizacije organskih snovi v anaerobnih pogojih, če ni drugih akceptorjev vodika, kot sta nitrat ali sulfat. Približno tretjina arhej za rast ne more uporabiti nobenega drugega vira energije in ogljika razen mešanice vodika in ogljikovega dioksida. Ta pojav je še posebej opazen med arhejami, izoliranimi iz geotermalnih okolij, kar je verjetno posledica odsotnosti ali nizkih ravni drugih substratov v vulkanskih okoljih. V teh okoljih je voda obogatena z vodikovim sulfidom, vodikom in amonijevimi ioni. Po drugi strani je koncentracija organskih spojin nizka, kar naj bi predvsem spodbujalo razvoj arhej, ki izkoriščajo vodik. Glede na biotehnološko uporabo metanogenih organizmov se raziskuje in razvija bioelektrokemična pretvorba ogljikovega dioksida v metan z uporabo napetosti in metanogenov za biološko proizvodnjo metana na osnovi ogljikovega dioksida (CO2-BMP). Pri tem se vodik uporablja kot reducent. Študije so pokazale, da ima ta tehnologija velik potencial za shranjevanje odvečne električne energije, kot je energija iz vetrnih ali sončnih elektrarn, v obliki kemične energije.

Molekularni vodik

Več kot tri četrtine svetovne proizvodnje vodika se trenutno pridobiva iz zemeljskega plina in premoga, medtem ko le majhen del proizvodnje temelji na električni energiji in obnovljivih virih. Vodik pa lahko proizvajajo tudi različni mikroorganizmi. Nekatere najbolj raziskane arheje za proizvodnjo molekularnega vodika so hipertermofilne vrste, kot so Desulfurococcus amylolyticus, Pyrococcus furiosus, Thermococcus barophilus, Thermococcus kodakarensis, Thermococcus litoralis, Thermococcus onnurineus in drugi. Doslej so najvišje proizvodne vrednosti dosegli pri T. onnurineus NA1, ki so ga gojili na ogljikovem monoksidu, pri čemer je v 30-litrskem bioreaktorju proizvajal vodik s hitrostjo 236 mmol/Lh. Podobno so pri proizvodnji vodika iz ogljikovega monoksida z uporabo seva T. onnurineus NA1 s prekomerno ekspresijo nativne dehidrogenaze ogljikovega monoksida (CODH) in hidrogenaze dosegli hitrost 124 mmol/Lh. Dodatno gojenje divjega tipa T. onnurineus NA1 v bioreaktorju pod tlakom pri 4 barih je povečalo hitrost proizvodnje na 360 mmol/Lh. Nadaljnji napredek pri proizvodnji vodika s temi in podobnimi arhejami bo odvisen od boljšega razumevanja njihovega metabolizma in njegove uporabe v industriji. Kot pri vseh bioloških proizvodnih sistemih je tudi v tem primeru pomembno vprašanje ustrezne energijske vire za izvedljivost industrijske proizvodnje. Nedavno je bilo predlagano, da bi format (HCOO-) lahko bil idealen industrijski vmesnik med fizikalno-kemijskim in biološkim področjem. V tem kontekstu bi format lahko deloval kot skladišče energije, ki se pridobi iz različnih industrijskih procesov, hkrati pa bi bil tudi vir energije za proizvodnjo goriv s pomočjo formatotrofnih mikrobov. Napredek pri uporabi formatotrofnih in karboksidotrofnih hidrogenogenih arhej kaže na potencial te tehnologije za postavitev dodatnega vira vodika kot čistega in obnovljivega nosilca energije.

Polihidroksialkanoati

Polihidroksialkanoati (PHA) so skupina raznolikih biopoliestrov. Sintetizirajo jih različne arheje in bakterije kot znotrajcelične spojine za shranjevanje ogljika in energije. Precej izjemne strukture jim omogočajo tvorbo biokompatibilnih polimerov različnih lastnosti. Poleg številnih sevov bakterij, izkaže se, da je za njihovo sintezo pomembna skupina arhej (Haloarchaea), ki predstavljajo razred Euryarchaeota. Slednje so precej lokalizirane v hipersalinskih okoljih in za optimalni razvoj zahtevajo precej visoke koncentracijo soli. Pokazano je, da Haloarchaea producira kratko verižne PHA kot so poli(3-hidroksibutirat), poli(3-hidroksibutirat-ko-3-hidroksivalerat) in terpoliester poli(3-hidroksibutirat-ko-3-hidroksivalerat-ko-4-hidroksibutirat). Terpoliestri skupaj s kopoliestri oziroma poli(3-hidroksibutirat-ko-4-hidroksibutirat) so precej uporabni v biomedicini, od umetnih krvnih žil in vsadkov za regeneracijo kosti do kirurških orodij, zobozdravstvenih namen ipd. Z ustrezno izbiro virov ogljika ter specifičnih substratov je možno nadzorovati sestavo kopoliestra. Ta nadzor naj bi omogočil kontrolirano proizvodnjo specifičnih PHA z želenimi lastnostmi. Pri analizi produkcije PHA s haloarhejo Haloferax mediterranei je ugotovljeno, da so se določeni PHA kopičili v obliki znotrajceličnih zrnc. Zato so sklepali, da proizvodnjo ni treba prekiniti takoj po izčrpanju eksogenega vira ogljika, saj po 24 urah po izčrpanju ostane 70 % proizvedenega PHA. Razlog za to je v tem, da arheje sprva porabijo nizkomolekularne polimere in tako obogatijo frakcijo pred ekstrakcijo PHA iz gojišča, kar precej poveča učinkovitost proizvodnje.

Površinski proteini

Proteini površinske plasti (S-layer proteins) predstavljajo sestavine celične stene, prisotne pri večini arhej in nekaterih bakterijah. Večinoma so močno glikozilirani in vloga takšnih glikoproteinov je, poleg vzdrževanja celične morfologije in celične delitve, tudi vpliv na odpornost celic proti osmotskem stresu. Površinski proteini so med najbolj razširjenimi biopolimeri na planetu, njihova proizvodna zmogljivost pa je omejena le z zmožnostjo sinteze biomase želenih organizmov ter z možnostjo same izolacije oziroma ekstrakcije slednjih proteinov iz takšne biomase. Glede na to, da je mreža površinske plasti pogosto izpostavljena ekstremnim okoljskim razmeram gostitelja, glikoproteini te mreže pri arhejah ohranijo svojo strukturo in delovanje v različnih pogojih, kar je precej uporabno načelo. Njihova funkcija ostane nespremenjena od pH 1 do pH 12, pri temperaturah do 120 °C in v različnih organskih topilih; proteini so tudi pogosto odporni proti proteazam. Zaradi teh lastnosti so arhejski površinski proteini predvsem uporabni v biotehnologiji. Izkaže se da je pomembna nanotehnološka uporaba njihovih fragmentov, in sicer iz razreda Sulfolobus acidocaldarius, za namen nanostrukturiranja površin in oblikovanja nanoklastrov. Tako je bila mogoča neposredna replikacija vzorca proteinske mreže v obliki urejenih kovinskih nanodelcev (Ti, Pd, Au). Arhejski površinski proteini naj bi lahko bili zanimiv produkt biotehnologije, ki bi ga v prihodnosti pridobivali iz izrabljene biomase, proizvedene v različnih drugih industrijskih proizvodnjah na osnovi arhej.

Plinski vezikli

Plinski vezikli (GV) so proteinske strukture, ki sodijo med naravnim organelam številnih bakterij in halofilnih arhej. Med štirimi sevi halofilnih arhej, ki jih sintetizirajo, le sev Halobacterium salinarium je uporaben za preučevanje potencialne uporabe v biotehnologiji. Plinski vezikli se pogosto uporabljajo kot ogrodja epitopov pri razvoju cepiv ter kot konstrastna sredstva pri medicinski diagnostiki. Eden izmed biotehničnih pristopov k oblikovanju cepiv je proizvodnja bioloških nanostrukturiranih ogrodij. Izkaže se, da so nanodelci seva Halobacterium salinarium (GV-nano delci) precej uporabni za prikaz želenega antigena na površini GV. Slednji se pridobijo, ko rekombinantne GV združimo s strukturnim proteinom GvpC v plinskem veziklu ter tako dobimo GV-nanodelec. Ena študija je prikazala imunski odziv na rekombinantni GV-nanodelec, ki je vseboval epitopsko podenoto virusa opičje imunske pomankljivosti (SIV). Podoben princip je dokazan pri številnih drugih patogenih, kar lahko nakazuje na to, da rekombinantni GV-nanodelci sprožijo dolgotrajen imunski odziv, kadar prikazujejo podenote različnih epitopov. Takšen sistem nanodelcev plinskih veziklov je v biotehnologiji precej uporaben, ker je proizvodnja in dalja obdelava načeloma enostavna.

Bakteriorodopsin

Bakteriorodopsin (bR) je fotoreceptorski protein v vijolični membrani (PM) Halobacterium salinarium. BR je v membrani organiziran v heksagonalni kristalni strukturi in deluje kot protonska črpalka, ki jo poganja svetloba, kar omogoča pretvorbo svetlobe v kemično energijo. Sestavljen je iz kovalentno vezanega barcterioopsina in retinala ter je analog rodopsinu v očeh sesalcev. Bakteriorodopsin se izraža iz gruče genov bop skupaj s proteinoma bat in prb, ki inducirata sintezo bR pri nizki vsebnosti kisika oziroma izpostavljenosti svetlobi. Izražena bR tvori izrazito obarvane lise v plazemski membrani, znane kot vijolična membrana (PM). Kljub temu da lahko več halofilnih arhej proizvaja bR, se H. salinarum uporablja kot modelni organizem za industrializacijo. H. salinarum ne uporablja preprostih virov ogljika, kot sta glukoza ali saharoza, temveč uspeva v koncentrirani slanici, bogati z aminokislinami, pri čemer sintetizira bR kot način prenosa energije od oksidativne fosforilacije k fototrofiji. Obstajajo različni pristopi za povečanje izkoristka bR iz H. salinarum. Optimizirani pogoji gojenja vključujejo sestavo gojišča, vir dušika, mešanje, intenzivnost svetlobe, razpoložljivost kisika in odstranjevanje zaviralnih metabolitov. Tehnologija PM se uporablja v vse večji meri in je še izboljšana tako, da nastane enostopenjski trifazni ekstrakcijski sistem (A3PS). Iz bR v A3PS je odstranjena znatna količina lipidov, kar je razvidno iz zmanjšanja utežnega razmerja med lipidi in bR z 0,6 na 0,2. Z enostopenjskim čiščenjem z A3PS je dosežen visok izkoristek bR (∼86 %). Očiščena bR, ekstrahirana z A3PS, je čistejša od bR, ekstrahirane z metodo ATPS, in je imela za 60 % več fototokov kot bR, ekstrahirana z metodo ATPS.

Biokatalizatorji

Arhejski encimi imajo velik biotehnološki potencial, predvsem za kloniranje biokatalizatorjev v mezofile za proizvodnjo, kot so E. coli ali glivni gostitelji. To omogoča hitro povečanje proizvodnje in, v primeru termofilnih encimov, tudi enostavno nadaljnjo obdelavo s toplotnim šokom. Biotehnološki pristopi k uporabi metanogenih, anaerobnih organoheterotrofnih arhej so v največji meri osredotočeni na kemikalije in proizvodnjo biogoriv. Po drugi strani, halofili so se izkazali kot dobri za preučevanje gostitelja za proizvodnjo proteinov. Kljub temu je prekomerno izražanje v gostiteljih, kot je E. coli, pogosto problematično, saj lahko nizke koncentracije citoplazemskih soli vplivajo na zlaganje proteinov, ker kovinski kofaktorji včasih niso pravilno vstavljeni v apoproteine. Zato so zaželene proteine homologno ali heterologno uspešno čezmerno izražali v drugih halofilih. Zaradi omejenosti genetskih sistemov pri večini halofilov je bila prekomerna ekspresija omejena na H. volcanii in Halobacterium sp. NRC-1. V primerjavi z drugimi halofilnimi arhejami je H. volcanii zaradi hitrejše rasti, lahko dostopnega genetskega orodja in stabilnega genoma primernejša za heterologno inženirstvo. Funkcija nove alkalne serinske proteaze (halolizin), identificirane v genomu nekultiviranega halofila, je preučevana s heterologno ekspresijo v H. volcanii. Slednji je uporabljen tudi kot ekspresijski sistem za olfaktorni receptor sesalcev, pri čemer je protein uspešno integriran v njegovo lipidno membrano. To je pokazalo, da H. volcanii uspešno izraža proteine sesalcev, temveč je predlagana tudi njegova potencialna uporaba za proizvodnjo hibridnih biosenzorjev na osnovi nanovezikul.

Zaključek

Arheje so na področju mikrobne biotehnologije zelo uporabne tako za industrijo kot za raziskave, saj se izboljšuje njihovo gojenje in genetski sistemi. Ena od glavnih prednosti arhej je zmožnost gojenja številnih ekstremnofilnih termofilov v nesterilnih pogojih in z uporabo poceni surovin, ki so običajno strupene za druge mikroorganizme. Glede na trenutno fazo razvoja, doslej so dostopna štiri proizvoda arhealnih celic, med katerim je tudi bakteriorodopsin. Drugi proizvodi arhej, kot so metan, vodik ter polihidroksialkanoati, so še v fazi razvoja. Nedavno je bilo odkritih veliko mehanizmov v povezavi z razvojem in industrijsko uporabo arhej, vendar šele zdaj pričakujemo, da se prikaže njihov potencial za biotehnološko uporabo.

Viri

[1] Jabłoński, Sławomir, Paweł Rodowicz, and Marcin Łukaszewicz. Methanogenic archaea database containing physiological and biochemical characteristics. International journal of systematic and evolutionary microbiology 65.Pt_4 (2015): 1360-1368. https://doi.org/10.1099/ijs.0.000065

[2] Koller, M., E. Chiellini, and G. Braunegg. Study on the production and re-use of poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) and extracellular polysaccharide by the archaeon Haloferax mediterranei strain DSM 1411. Chemical and Biochemical Engineering Quarterly 29.2 (2015): 87-98. https://doi.org/10.15255/CABEQ.2014.2058

[3] Shibata, A., et al. Photocurrent of purple membrane adsorbed onto a thin polymer film: action characteristics of the local anesthetics. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 23.4 (2002): 375-382. https://doi.org/10.1016/S0927-7765(01)00272-7

[4] Shiu, Pei-Jiun, Hsiu-Mei Chen, and Cheng-Kang Lee. One-step purification of delipidated Bacteriorhodopsin by aqueous-three-phase system from purple membrane of Halobacterium. Food and Bioproducts Processing 92.2 (2014): 113-119. https://doi.org/10.1016/j.fbp.2014.01.003