Atipična sistema segregacije pri plazmidih z nizkim številom kopij

Uvod

Plazmidi z nizkim številom kopij kodirajo vsaj en sistem segregacije, vendar se je pri številnih izkazalo, da ne kodirajo genov za tipične sisteme segregacije, kar nakazuje na obstoj alternativnih sistemov. Atipična sistema segregacije, ki sta odvisna zgolj od enega DNA-vezavnega proteina in ne vključujeta NTPaz, sta prisotna v stafilokoknem plazmidu pSK1, kjer je DNA-vezavni protein Par, in v konjugativnem plazmidu E.coli R388, kjer je DNA-vezavni protein StbA.

pSK1 Par

Lokus par

Gen par kodira protein pSK1 Par in se prepisuje v nasprotni smeri z istega promotorja kot gen rep, odgovoren za iniciacijo replikacije. Medgenska regija med genoma rep in par vsebuje promotor rep, promotor protismerne RNA, ki je komplementarna regiji rep (PrnaI), in razporeditveno mesto. Mesto začetka podvojevanja pSK1 se nahaja znotraj gena rep. Razporeditveno mesto, ki ga prepozna protein Par, je sestavljeno iz sedmih ponovitev skupnega zaporedja DNA TTAGGYRSYWAR (Y = C/T, R = A/G, S = C/G, W = A/T), ki vsebuje palindrom TTAG(X)₄CTAA. Ppar ima regijo – 35 zapisano med tretjo in četrto ponovitvijo razporeditvenega mesta, regija – 10 zajema drugo in tretjo ponovitev. Začetno mesto transkripcije se nahaja v drugi ponovitvi razporeditvenega mesta. Protein Par uravnava izražanje lastnega gena par tako, da se veže na ponovitve razporeditvenega mesta v promotorski regiji.

Razširjenost lokusa par med plazmidi

Razširjenost lokusa par je bila do sedaj raziskovana samo med stafilokoknimi plazmidi. Stafilokokni plazmidi z več kot 10 tisoč baznimi pari (kbp) se podvajajo po mehanizmu theta, majhni plazmidi (manj kot 10 kbp) pa na način kotalečega se kroga. V študiji 93-tih dokončno sekvencioniranih stafilokoknih plazmidov pri nobenem od 29-tih majhnih plazmidov ni bil prepoznan noben od znanih sistemov segregacije, medtem ko so geni, ki kodirajo proteine s funkcijami segregacije, prisotni pri večjih plazmidih (več kot 10 kbp). Najpogostejši so geni, homologni pSK1 lokusu par. Prisotni so pri približno 80 % plazmidov z več kot 10 kbp, lokus par je najpogosteje prisoten pri srednje velikih plazmidih (20-37 kbp).

Protein Par

pSK1 Par gradi 245 aminokislinskih ostankov, ki tvorijo tri domene. To so N-končna domena z motivom wHTH (agl. »winged helix-turn-helix«), osrednja domena, ki jo predstavlja ovita vijačnica (CC) in verjetno sodeluje pri oligomerizaciji proteina, ter C-končna domena, ki zamejuje kratko neurejeno regijo. Motiv wHTH v N-končni domeni oblikujeta dve α-vijačnici, pri čemer se α-vijačnica 2 veže v velikem žlebu DNA. Organizacija razporeditvenega mesta v sedmih sosednjih ponovitvah, ki so med seboj ločene z vsaj enim in največ 19-timi bp ali pa se med seboj prekrivajo, namiguje, da se na vsako ponovitev veže en protein Par. Večina kontaktov med proteinom Par in DNA je hidrofobnih ali pri njih sodelujejo molekule vode. Direktna vodikova vez z bazo je le ena. Ovita vijačnica v osrednji domeni najverjetneje posreduje pri nastanku dimera dimerov. Model celotnega proteina Par, vezanega na DNA, nakazuje, da osrednja domena CC posreduje pri nastanku Par A dimerov, ki se skozi interakcije med C-konci osrednjih domen CC povežejo v dimere dimerov. Oligomerizacija ima pomembno vlogo pri segregacijski funkciji, ki jo opravlja Par.

R388 StbA

Lokus stbA

Protein StbA je kodiran v stb operonu, ki se divergentno prepisuje s trwABC mobilnega operona (MOB). V medgenski regiji med operonoma se nahaja mesto začetka konjugativnega prenosa (oriT) in razporeditveno mesto stbS, ki ga sestavljata dva sklopa petih ponovitev skupnega zaporedja DNA (T/C)TGCATCAT (stbDR). Sklopa sta med seboj ločena z dvema baznima paroma. Regiji – 35 in – 10 PStbA sta najverjetneje zapisani znotraj stbDR. Protein StbA je pomemben transkripcijski regulator plazmida, saj je represor lastnega promotorja ter štirih drugih promotorjev plazmida R388, ki vsebujejo od dva do pet ponovitev stbDR.

Razširjenost lokusa stbA med plazmidi

Razširjenost lokusa stbA je bila raziskovana med enterobakterijskimi plazmidi. V zbirki podatkov, ki zajema 971 sekundarnih enterobakterijskih replikonov, so homologi StbA prisotni v okoli 14 % plazmidov, medtem ko so bili homologi StbA najdeni v 17 % vseh enterobakterijskih plazmidov, ki so v zbirki podatkov RefSeq. Večina plazmidov (92 %), v katerih so prisotni homologi StbA, po velikosti sodi med srednje velike plazmidi (20-150 kbp). Glede na aminokislinska zaporedja homologov StbA lahko člane družine StbA razdelimo v štiri večje skupine. Skupine 1, 2 in 4 so omejene na γ- in β-proteobakterije, skupina 3 vključuje še cianobakterije.

Protein StbA

R388 StbA je majhen protein, ki ga gradi 110 aminokislinskih ostankov. Obsega dve domeni – dobro ohranjeno N-končno domeno z motivom HTH, in slabo ohranjeno C-končno domeno z najverjetneje neurejeno regijo. Znana je kristalna struktura prvih 75-tih aminokislinskih ostankov (StbA_1-75), ki predstavljajo N-končno domeno in DNA-vezavno mesto na proteinu. Motiv HTH je tipičen in ga oblikujejo tri α-vijačnice, od katerih bi morala biti α-vijačnica 3 odgovorna za prepoznavo in specifično vezavo v veliki žleb DNA. Na podlagi poskusov in vitro se verjetno na vsaka dva zaporedja stbDR vežeta dve domeni StbA_1-75, ker celoten StbA in domena StbA_1-75 izkazujeta visoko kooperativnost vezave na stbDR. V modelu domene StbA_1-75 vezane na DNA se StbA poveže v dimer in se z α-vijačnico 3 vsakega monomera veže v veliki žleb DNA. Oba monomera stopata v stik z DNA z enake strani, kar se ujema z organiziranostjo razporeditvenega mesta stbS. Pri oligomerizaciji StbA je ključna dolga α-vijačnica 1. Vloga C-končne domene pri oligomerizaciji ni znana, vendar ima domena ključno vlogo pri aktivnosti StbA in vivo.

Modeli mehanizma segregacije

Vezava plazmidov na nukleoid

Eksperimenti v E.coli in simulacije in silico so pokazali, da so plazmidi brez sistema segregacije odsotni v nukleoidu in se ohranjajo na prehodu med citoplazmo in nukleoidom. Pri takšnih plazmidih so predlagan mehanizem segregacije entropijske sile, ki fizično ločijo plazmide od kromosoma, zaradi česar plazmidi niso prisotni v nukleoidu. To je značilno predvsem za majhne kromosome z manj kot 25 kbp, ki lahko hitro difundirajo po celici, večji plazmidi pa potrebujejo sistem segregacije. Možen mehanizem segregacije, ki bi nasprotoval entropiji, bi bila pritrditev plazmidov na nukleoid s fizičnimi interakcijami, za katere bi poskrbel protein s segregacijsko funkcijo. S predlagano strategijo se skladajo rezultati poskusa, v katerem so se plazmidi z odsotnim StbA v hčerinskih celicah po celični delitvi razporedili izven nukleoida.

Model "kromosomskega" priskledništva

Za plazmida pSK1 in R388 je bil predlagan model »kromosomskega« priskledništva, v katerem se segregacijski kompleks plazmida poveže z nukleoidom preko direktnih interakcij s kromosomskimi zaporedji ali preko posrednika. Pri plazmidu pSK1 bi se lahko en monomer Par dimera dimerov vezal na razporeditveno mesto, drug monomer pa bi bil v interakciji s posrednikom, vezanim na nukleoid. Genomi S.aureus imajo veliko zaporedij, na katere bi se Par lahko vezal. Na kromosomu E.coli kombinacije zaporednih ponovitev dveh stbDR, med seboj ločenih z dvema baznima paroma in nujnih za zaznavo vezave in vitro, ni. Pri interakciji med segregacijskim kompleksom plazmida in nukleoidom bi lahko posredoval protein, vendar do sedaj kot takšen posrednik ni bil prepoznan noben protein.

Medsebojno delovanje segregacije in konjugacije

Plazmid R388 v enakem operonu (stb) kodira dva proteina, ki skozi uravnavanje segregacije in konjugacije vplivata na položaj plazmidov. Plazmidi so pomešani z nukleoidom, kadar StbA inhibira konjugacijo in sodeluje pri segregaciji. Med konjugacijo, ki jo spodbuja StbB, se plazmidi nahajajo ob membrani T4SS. Ob inaktivaciji StbA se frekvenca prenosa 50-krat poveča. Če je StbA prisoten, StbB sodeluje samo pri konjugaciji. Sistem StbAB bi predstavljal evolucijsko varčen mehanizem, ki z le dvema proteinoma zagotavlja ohranjanje plazmidov.

Zaključek

Pri srednje velikih plazmidih z nizkim številom kopij je prisoten sistem segregacije z enim proteinom. Atipična sistema v plazmidih pSK1 in R388 si kljub navidezni nepovezanosti delita skupne lastnosti, kot so razširjenost med srednje velikimi plazmidi, število kopij in funkcije segregacijskih proteinov.

Viri

P. Siguier, M. Campos, F. Cornet, J.-Y. Bouet, in C. Guynet, „Atypical low-copy number plasmid segregation systems, all in one?“, Plasmid, let. 127, str. 102694, jul. 2023, doi: 10.1016/j.plasmid.2023.102694.
J.-Y. Bouet in B. E. Funnell, „Plasmid Localization and Partition in Enterobacteriaceae“, EcoSal Plus, jun. 2019, doi: 10.1128/ecosalplus.esp-0003-2019.
J. E. S. Shearer idr., „Major Families of Multiresistant Plasmids from Geographically and Epidemiologically Diverse Staphylococci“, G3 GenesGenomesGenetics, let. 1, št. 7, str. 581–591, dec. 2011, doi: 10.1534/g3.111.000760.
H. Y. Chan idr., „Molecular Analysis of pSK1 par: A Novel Plasmid Partitioning System Encoded by Staphylococcal Multiresistance Plasmids“, J. Mol. Biol., let. 434, št. 19, str. 167770, okt. 2022, doi: 10.1016/j.jmb.2022.167770.
C. Guynet in F. de la Cruz, „Plasmid segregation without partition“, Mob. Genet. Elem., let. 1, št. 3, str. 236–241, sep. 2011, doi: 10.4161/mge.1.3.18229.