Automated Multiplexing Quantum Dots in Situ Hybridization Assay

Povzeto po: Zhang W, Hubbard A, Brunhoeber P, Wang Y, Tang L. Automated Multiplexing Quantum Dots in Situ Hybridization Assay for Simultaneous Detection of ERG and PTEN Gene Status in Prostate Cancer. J Mol Diagn, 2013, 15(6), str. 754-764.

UVOD

Rak prostate je ena najpogostejših oblik rakavih obolenj pri moških. Pomembna dejavnika, ki vplivata na razvoj raka prostate sta starost in družinska obremenjenost. V raziskavi predstavljeni v članku, so preverjali uporabo kvantnih točk (QD – "quantum dots") pri razvoju avtomatiziranega multipleksnega testa in situ hibridizacije (ISH) za detekcijo genov ERG in PTEN v vzorcih pripravljenih iz tkiva prostate. QD so polprevodniški nanokristali z ozkim emisijskim spektrom, ki olajša sočasno detekcijo več celičnih tarč. So zelo svetli in so manj nagnjeni k bledenju kot organski fluorofori, kar omogoča izboljšanje razmerja med signalom in šumom. ERG je onkogen, ki se prepiše v protein ERG, ta pa deluje kot transkripcijski regulator. PTEN je tumor supresorski gen, ki se prepiše v fosfatazni in tenzinski homolog (PTEN), ki je udeležen pri regulaciji celičnega cikla, kjer preprečuje prehitro celično rast in delitev celic. Preureditev ERG in delecija PTEN sta najpogostejši genomski spremembi pri raku prostate.

EKSPERIMENTALNI DEL

Za delo so uporabili avtomatski štiribarven multipleksen QD ISH test, ki omogoča detekcijo klinično pomembnih biomarkerjev raka prostate. Pridobili so deset vzorcev tkiva prostate, od tega je bilo osem vzorcev diagnosticiranih kot benigno tkivo, dva pa kot rak prostate. Razvili so štiri DNA sonde: ERG3p, ERG5p, PTEN in CEN10. Sondi ERG3p in ERG5p sta bili oblikovani tako, da ciljata centromerno ter telomerno regijo na kromosomu 21, kjer se nahaja ERG. Sondo ERG5p so označili z DIG, ERG3p sondo pa so označili z DNP. Sondo PTEN so oblikovali tako, da je ciljala regijo kromosoma 10, na kateri se nahaja PTEN, označili pa so jo s TS. Sondo CEN10 so pridobili s pomočjo plazmida pA10RP8, ki cilja na centromero kromosoma 10, označili so jo z NP. Za detekcijo so uporabili štiri anti-haptenska protitelesa konjugirana s QD655, ki sveti rdeče, QD565, ki sveti zeleno, QD605, ki sveti roza in QD525, ki sveti modro.

Avtomatska štiribarvna ERG/PTEN QD in situ hibridizacija

Po pred obdelavi, so vzorcem dodali vse štiri DNA sonde. Denaturaciji genomske DNA in DNA sond pri 85°C za 8 minut, je sledila hibridizacija sond, ki je trajala 6 ur pri 44°C. Po treh spiranjih pri 72°C za 8 minut, so vzorcem dodali raztopino protiteles konjugiranimi s QD ter vse skupaj inkubirali 60 minut pri 37°C. Po trikratnem spiranju vzorcev z reakcijskim pufrom, so dodali DAPI.

REZULTATI

Ovrednotili so zmogljivost štiribarvnega ERG/PTEN QD ISH testa pri optimalni pred obdelavi vzorcev. Signale so prešteli pri 389 vzorcih, ki so jih pridobili iz desetih tkiv prostate. Izkazalo se je, da je bilo 91% obarvanj sprejemljivih tako za ERG3p ter ERG5p, kot tudi za PTEN ter CEN10. Ne sprejemljivih je bilo samo 36 od 386 preparatov, od katerih je pri 28 prišlo do visokega ozadja pri QD655, pri osemih pa so bili signali prešibki oziroma jih sploh ni bilo. Med preparati s sprejemljivim obarvanjem je bilo 280 takih, ki so jih pridobili iz osem vzorcev benignega tkiva prostate in 70 takih, ki so bili pridobljeni iz dveh vzorcev tkiv z rakom prostate. Naključno so izbrali 19 preparatov pripravljenih iz dveh benignih tkiv in dveh tkiv z rakom prostate, katerim so prešteli signale za ERG3p, ERG5p, PTEN in CEN10 na jedro celice v treh različnih dneh. Tako pridobljeni podatki so pokazali, da so rezultati obarvanja konstanti skozi vse dni štetja. Pri preparatih iz vzorca benignega tkiva se je vrednost pozitivnih celic z ERG preurejanjem gibala med 0 ter 6%, razmerje PTEN/CEN10 je bilo med 0,94 do 1,0. Pri preparatih iz drugega benignega tkiva pa se je procent pozitivnih celic gibal od 0% do 2%, razmerje signalov PTEN/CEN10 pa je bilo med 0,9 in 1,1. Pri preparatih pripravljenih iz tkiva z rakom prostate se je vrednost pozitivnih celic z ERG preurejanjem gibala med 78% do 90%, razmerje med signali PTEN/CEN10 je bilo med 0,8 in 0,9. Pri preparatih pripravljenih iz drugega tkiva raka prostate pa se je vrednost pozitivnih celic gibala med 74% ter 88%, razmerje signalov PTEN/CEN10 pa je bilo 0,0.

ZAKLJUČEK

Štiribarven QD ISH test omogoča multipleksno detekcijo molekulskih biomarkerjev. Hkrati omogoča detekcijo štirih genomskih tarč na enem samem preparatu in tako poveča učinkovitost uporabe vzorca tkiva. Za samo interpretacijo signalov je potreben samo fluorescenčen mikroskop. Svetlost QD in njihova odpornost proti bledenju omogoča enostavno določevanje signalov. Popolna avtomatizacija testa pa omogoča hitro pridobitev rezultatov, ki so konstantni in natančni.