BeeYeast

Estonijska podiplomska (postgraduate) ekipa EstoniaTUIT je leta 2023 na iGEM tekmovanju s projektom BeeYeast osvojila glavno nagrado v svoji skupini. Njihov projekt je dostopen na povezavi: https://2023.igem.wiki/estonia-tuit/home

Avtor povzetka: Mateja Milošević

Uvod

Medonosna čebela ima velik ekološki, gospodarski in kulturni pomen v človeški civilizaciji. Spadajo med najpomembnejše opraševalce rastlin in so nujne za ohranjanje biodiverzitete. Medonosne čebele oprašujejo 80 odstotkov vseh cvetočih rastlin, vključno z več kot 130 vrstami sadja in zelenjave [1, 2]. Z ekonomske strani so tudi zelo pomembne kot komercialni opraševalci, kjer je njihova tržna vrednost samo v Združenih državah Amerike ocenjena na približno 15–20 milijard dolarjev na leto, svetovno pa čebele kot glavni opraševalci rastlin zagotavljajo 153 milijard evrov, kar predstavlja 9,5 % skupne ekonomske vrednosti kmetijske proizvodnje, ki se neposredno uporablja za človeško hrano [1, 3]. Na žalost, populacije medenih čebel se po vsem svetu zmanjšujejo. Vzroke za odmiranje čebel prepisujejo manjšanju biodiverzitete rastlin, povečanju uporabe pesticidov in med-vrstnem prenosu patogenov in parazitov. Za največje izgube čebeljih družin so odgovorne parazitske pršice iz rodu Varroa, ki prenašajo virus deformiranih kril (ang. Deformed wing virus, DWV) [1, 2]. Pršice se hranijo na čebeljih zalegah in pri tem nenamerno prenašajo DWV. Poleg tega pršice oslabijo imunski sistem čebel, zaradi česar so bolj dovzetne za okužbe z DWV. Posledično, kombinacija infestacij Varroa pršic in DWV močno vpliva na čebelje družine, kar vodi v motnje v koloniji in predstavlja pomembno grožnjo populacijam opraševalcev in kmetijskim ekosistemom. Trenutne prakse za preprečevanje ali obvladovanje virusnih okužb, kot je uporaba pesticidov, ne zagotavljajo zadostnih rezultatov za ustavitev upadanja populacij čebel [1, 2, 4, 5].

Imunski sistem čebel

Protivirusni obrambni mehanizmi medonosne čebele vključujejo interferenčno RNA (iRNA), kaskade prenosa signala, ki jih sprožijo PAMP-i (ang. pathogen associated molecular patterns) in generiranje reaktivnih kisikovih zvrsti [6]. Ob okužbi z virusom DWV, ki je RNA virus [7], je značilna prisotnost dolgih dsRNA v citosolu okužene celice, kar pa ni tipični produkt evkariontov, zato jih gostitelj prepozna kot molekule PAMP. Prvi korak je cepitev dolgih dsRNA z encimom RNAza III, ki je podoben proteinu Dicer. Dolge dsRNA molekule se cepijo na majhne interferenčne RNA (ang. small interfering RNA; siRNA) dolžine 21-22 baznih parov. Molekule siRNA se nato vežejo na protein Argonaut, ki je del kompleksa utišanja RNA (ang. RNA induced silencing complex; RISC). Obdrži se ena veriga molekule siRNA (vodilna veriga), ki se uporabi pri specifičnem ciljanju sorodnih sekvenc virusnih genomov in njihovi cepitvi [1, 5]. Ta proces vodi do cepitve virusne RNA, s čimer se virusu prepreči podvajanje. Ustvarjanje siRNA kot naravni imunski odziv čebel bi zaviralo izražanje virusnih proteinov, vendar to ni dovolj [1].

Rešitev

iGEM skupina EstoniaTUIT v svojem projektu želi onemogočiti izražanje virusnih proteinov v celicah čebel tako, da bi inducirali iRNA odziv. Strategija vključuje gensko spremenjene celice kvasovk, ki izražajo siRNA, ki za tarčo imajo genom virusa DWV. Gensko spremenjene kvasovke bi dostavili čebelam kot hrano ali z vbrizgavanjem ekstrakta, ki vsebuje siRNA direktno v satje. Cilj je kopičiti siRNA v čebelah kako bi čebele bile bolj pripravljene na okužbo in jih tako zaščititi pred virusom [1]. Kvasovka Saccharomyces cerevisae nima naravnega mehanizma za proizvodnjo iRNA. Z izražanjem ključnih komponenti za proizvodnjo iRNA (proteina Dicer in Argonaut) iz sorodne kvasovke Saccharomyces castellii bi dosegli učinkovito izražanje željenih konstruktov siRNA proti virusu DWV. Konstrukti se vnesejo v celice s plazmidom in se izrazijo v obliki kratke-lasnične RNA (ang. short-hairpin RNA, shRNA), ki nadalje reže protein Dicer v siRNA. Konstrukte lahko oblikujejo in optimizirajo z in silico pristopih, tako da so čim bolj specifični. Test učinkovitosti konstruktov siRNA je narejen tako, da je tarčno zaporedje virusa fuzirano s kodirajočim zaporedjem za zeleni fluorescentni protein (GFP) z namenom merjenja učinkovitosti inhibicije. V principu, čim bolj učinkovit je konstrukt siRNA bo manjša raven izražanja GFP-ja, ker je prišlo do RNA interference in posledično do utišanja tega gena. Sistem se lahko uporablja za iskanje najboljših kandidatov za siRNA proti virusu DWV in se lahko potencialno razširi za presejanje drugih učinkovitih ciljnih zaporedij drugih virusnih patogenov [1].

Načrtovanje in in silico testi

Zaradi optimizacije dela, projekt je strateški načrtovan v 4 faze:

1. Proizvodnja shRNA v kvasovkah

2. Procesiranje shRNA v kvasovkah s proteinom Dicer

3. Dostava siRNA v celicah čebel

4. Aktivna iRNA v čebelah

Modeliranje proizvodnje shRNA v kvasovkah je bilo ključno za optimizacijo različnih vidikov procesa, kot je: izbira promotorja za ekspresijo shRNA in proteina Dicer, učinkovita koncentracija, uspešnost zvitja shRNA in njena stabilnost [1]. V tej fazi projekta so se fokusirali najti odgovore na naslednje izzive: - Koliko učinkovita bo anti-DWV siRNA in kako ločiti bolj učinkovite od manj? - Kolika je stabilnost konstrukta? Če konstrukt ostane učinkovit in aktiven in vivo v čebelah?

V 1. fazi so z računalniškim orodjem GenScript siRNA Target Finder našli ustrezna specifična tarčna zaporedja na genomu virusa DWV. Predstavljeno je 10 potencialnih shRNA variant, ki so jim nadalje z matematičnimi in računalniškimi modeli testirali biofizikalne lastnosti. Rezultati kažejo, da 6 različnih zaporedji shRNA ima maksimalno raven izražanja in pravilnega zvitja, 1 pa ima najmanjšo. Iz tega so zaključili da same razlike v zaporedju vplivajo na proizvodnjo, razgradnjo in zvitje; kjer je glavna determinanta kopičenja shRNA njena stabilnost [1].

Po sintezi shRNA, v 2. fazi so računalniško testirali njeno molekularno procesiranje v funkcionalno siRNA. Divji tip kvasovk ne vsebuje encima Dicer, ki reže lasnično zanko na shRNA, pri čem nastane siRNA. Zato so se v tej fazi mogli odločiti, če bi delo nadaljevali tako, da bi uvedli zapis za Dicer v S. cerevisae ali bodo spremenili kvasovke tako, da izražajo samo shRNA, kjer bi procesiranje v siRNA potekalo v celicah čebel. Z analizo so odkrili, da so z uvedbo encima Dicer iz sorodne kvasovke S. castellii uspešno dosegli zadovoljivo raven izražanja encima Dicer in tako večino sintetizirane shRNA pretvorili v siRNA [1].

Ker je namen narediti kvasovke, ki izražajo specifično siRNA, ki bi potem dali čebelam kot prehranski dodatek z namenom preventivne zaščite čebel proti okužbi z virusom DWV, so v 3. fazi razvili model in testirali, če je siRNA dovolj stabilna v prebavnem sistemu čebel in sposobnost celic, da sprejemajo siRNA. V literaturi je omenjeno da sta za absorbcijo siRNA v insektih pomembni Sid-u podobni proteini in od klatrina-povzročena endocitoza [8]. Ker mehanizmi niso v celoti znani, modele so pripravili na osnovi kinetičnih konstanti iz literature [9]. Simulacija kaže, da se privzem siRNA zgodi hitro (vrh prevzema je približno pri 25 min.) in nakazuje, da je potrebna kontinuirna dostava siRNA, da bi se ohranila ustrezno visoka koncentracija siRNA. Iz modelov, najbolji med kandidati so lahko dosegli koncentracijo 8 nM v celicah, medtem da so najbolj nestabilni kandidati lahko dosegli koncentracijo 2 nM [1].

V 4. fazi modeliranja so združili razpoložljive informacije z modelom, ki opisuje razgradnjo siRNA. Tako so ocenili aktivno koncentracij siRNA in Argonauta za učinkovit boj proti okužbi z DWV. Rezultati testov nakazujejo, da se pri 2 nM siRNA večina DWV RNA razgradi v nekaj minutah [1].

Sestavljanje konstruktov

Inženirske odločitve so temeljile na rezultatih objavljenih v literaturah, računalniškem modeliranju in empiričnih ugotovitvah, ki so izhajale iz laboratorije raziskovalcev. Kloniranje so delali po metodi Golden Gate. Ker divji tip S. cerevisae ne vsebuje proteina Dicer in Argonaut, ki so nujni za generiranje siRNA iz shRNA, kodirajoča zaporedja so klonirali v ekspresijsko kaseto in so jih izražali v S. cerevisae. Zapisa za proteina so vzeli iz sorodne kvasovke S. castellii in so jih izražali pod kontrolo dva različna, močna konstitutivna promotorja, ki so dobro opisani kot biokocke v registru iGEM. Vsako od 10 variant shRNA so klonirali v 2µ plazmide pod kontrolo močnega inducibilnega promotorja pGAL1, ki so uravnavali s kontrolo koncentracije galaktoze. Tarčno zaporedje genoma virusa DWV so fuzirali s kodirajočim zaporedjem za GFP in so konstrukt izražali pod kontrolo močnega inducibilnega promotorja pGAL1. Tako so generirali senzor s katerimi so merili učinkovitost iRNA, kjer čim bolj učinkovit je konstrukt siRNA bo manjša raven izražanja GFP-ja, ker pride do utišanja tarčnega zaporedja gena. Eksperimentalno, učinkovitost iRNA so določili z merjenjem fluorescence GFP-ja s pretočno citometrijo. Gensko spremenjene kvasovke so gojili 24h pri 30 °C in so kulture redčili do OD₆₀₀ vrednosti = 1. Celicam so inducirali izražanje shRNA in konstrukta GFP-tarčno zaporedje in so merili fluorescenco 24h po induciranju. V odsotnosti shRNA so kulture z GFP reporterjem pokazale veliko višji signal. Kot ozadje so uporabili kulture, ki jim niso inducirali izražanje reporterskega proteina. Med 10 variant shRNA konstruktov, ki so jih testirali, so se intezitete fluorescence bistveno razlikovale in so sklepali, da lahko virusno zaporedje, vneseno v 3'-UTR transkripta, vpliva na stabilnost mRNA. Z najbolj učinkovitimi konstrukti so dosegli relativno zmanjšanje intenzitete v fluorescenci za več kot 50% [1].

Zaključek

Narejeni poskusi vodijo do treh pomembnih zaključkov. Prvo, predstavljeno delo potrjuje, da je uvedba proteinov Dicer in Argonaut v S. cerevisae zadostna za rekonstitucijo odziva iRNA. Drugo, poskusi kažejo, da z uvedbo virusnega zaporedja v 3'-UTR kodirajočega zaporedja za GFP lahko ciljamo virusna zaporedja s shRNA in enostavno merimo učinkovitost iRNA. Tretje, s testiranimi anti-DWV siRNA kot potencialna terapija proti virusu DWV, so določili močne kandidate za nadalje testiranje na čebelah [1].

Reference

[1] EstoniaTUIT iGEM project 2023. Pridobljeno s: https://2023.igem.wiki/estonia-tuit/home [Dostopano 4 april 2024]

[2] MARTIN, Stephen J., et al. Global honey bee viral landscape altered by a parasitic mite. Science, 2012, 336.6086: 1304-1306.

[3] KHALIFA, Shaden AM, et al. Overview of bee pollination and its economic value for crop production. Insects, 2021, 12.8: 688.

[4] TEHEL, Anja; BROWN, Mark JF; PAXTON, Robert J. Impact of managed honey bee viruses on wild bees. Current opinion in virology, 2016, 19: 16-22.

[5] PIRNAT, Tanja, 2021, Vpliv pesticidov in okužbe s pršico Varroa destructor na izražanje genov, povezanih z imunostjo, pri medonosni čebeli delavki Apis mellifera [na spletu]. Doktorska disertacija. Ljubljana : T. Pirnat. [Dostopano 4 april 2024]. Pridobljeno s: https://repozitorij.uni-lj.si/IzpisGradiva.php?lang=slv&id=134342

[6] BRUTSCHER, Laura M.; DAUGHENBAUGH, Katie F.; FLENNIKEN, Michelle L. Antiviral defense mechanisms in honey bees. Current opinion in insect science, 2015, 10: 71-82.

[7] LANZI, Gaetana, et al. Molecular and biological characterization of deformed wing virus of honeybees (Apis mellifera L.). Journal of virology, 2006, 80.10: 4998-5009.

[8] CAPPELLE, Kaat, et al. The involvement of clathrin‐mediated endocytosis and two Sid‐1‐like transmembrane proteins in double‐stranded RNA uptake in the Colorado potato beetle midgut. Insect molecular biology, 2016, 25.3: 315-323.

[9] ROH, Esther H.; SULLIVAN, Millicent O.; EPPS III, Thomas H. A kinetic modeling platform for predicting the efficacy of siRNA formulations in vitro and in vivo. STAR protocols, 2022, 3.4: 101723.