Beton-samoporavljajući sistem

Sažetak iGEM projekta SZU-China

Uvod

Kao što svi znamo, armirani beton je najčešće korišten građevinski materijal u svijetu. Beton je otporniji na ispiranje, a šipke mogu držati visoku čvrstoću rastezljivosti. Zajedno mogu napraviti savršeni spoj za izgradnju zgrada. Međutim, kako vrijeme prolazi, u betonu se pojavljuju male pukotine na milimetarskoj razini. Zovemo ih mikro-pukotine. Ove mikro-pukotine imaju potencijal da se prošire i postanu dublje. Zatim, kad se pukotine prošire, vodena para u zraku prodrijet će u njih i doći će korozije čelične šipke unutra. Korozivne čelične šipke obično su 3-4 puta veće od izvornog volumena, što dovodi do toga da zid nabubri, a pukotine se još više prošire. To dovodi do još većeg ulaska vodene pare u pukotine i daljnje korozije čelika što značajno smanjuje radni vijek gotovo svih javnih konstrukcija poput tunela i mostova. Prema istraživanjima, Europska unija troši 60 milijardi eura na popravak tunela i mostova godišnje.

Rješenje

Ove godine je tim iz Kine nastojao oblikovati sustav "samopopravljanja" za beton. To jest, kada se pojavi mikro-pukotina, sustav se uključi i beton se može početi oporavljati. Odabrali su kalcijev karbonat kao "lijek" za te pukotine. Proizveli su vrstu bakterije koja proizvodi kalcijev karbonat, a zatim je ugradili u beton u obliku mikrokapsule. Kada beton počne pucati, kapsula se otvori kako bi aktivirala bakterije. Na taj način, one mogu početi proizvoditi CaCO3, ispunjavajući pukotine.

Postoje 3 glavna gena koji su ključni za izgradnju ovog sustava:

GERMINACIJA

GerA gen služi kao biosenzor za početak germninacije spora kada je dostupan tekući L-alanin za indukciju GerA receptora.

KARBONSKA ANHIDRAZA

Gen za karbonsku anhidraza služi kao modul za proizvodnju CO32-, koji se zatim veže s slobodnim Ca2+ formirajući CaCO3 kao materijal za punjenje pukotina.

ALKALNA OTPORNOST

nhaC gen služi kao Na+ -H+ antiporter, čime se poboljšava otpornost na alkalne uvijete.

Kroz metode sintezne biologije, značajno su povećali tolerancu na alkalne uvijete, stopu germinacije i mineralizacijsku sposobnost Bacillus subtilisa. Zatim su koristili vrstu posebnog MCC materijala kako bi omotali spore Bacillus subtilis u mikrokapsule, istovremeno dodavajući potrebne hranjive tvari za germinaciju. Ova mikrokapsule je zatim u određenom omjeru ugrađena u beton. Kada se pojave mikro-pukotine unutar građevine, mikrokapsule pucaju zbog napetosti lomljenja zida te voda ulazi razgrađuje hranjivu tvar što stimulira spore u status germinacije i konačno se vraća u normalni metabolizam. Karbonska anhidraza Bacillus subtilis promiče hidrataciju CO2 kako bi se proizveo HCO32-, koji se veže na slobodne Ca2+ i OH- u okolišu kako bi se formirao talog kalcijevog karbonata, što omogućava mikropukotinama samopopravljanje te izolaciju od daljnje korozije.

Dizajn

Odabir šasije

Bacillus subtilis izabrali su za šasiju zbog njegove sposobnosti stvaranja spora, što omogućava da bakterije ostanu dormantne dulje vrijeme i zaštićene od teških uvijeta u okolišu kao što su ekstremno visok ili nizak pH, visoke temperature i suša. Od svim sojeva Bacillus Subtilis, B.S168 je najčešći. Međutim, budući da Bacillus Subtilis iz tog soja izlučuje probavne enzime koji prekidaju egzogenu ekspresiju gena, odabran je modificirani soj - WB800, koji nema probavnih enzima.

Kako ugraditi bakterije u beton?

Kako bi WB800 ispravno funkcionirao u betonu za ispunjenje pukotine, trebalo je osigurati da bakterija ostane u obliku spore - stabilno i dormantno stanje koje će ostati neprekinuto dok se ne pojave pukotine. Dizajnirali su vrstu mikrokapsule koja se sastoji od mikrokristalnog celuloznog materijala koji prekriva/zaštićuje spore izvana. MCC je kratica za mikrokristalnu celulozu - stabilan i netoksičan kompozitni materijal, koji čuva spore u izolaciji od vanjskog okruženja. Stoga su dizajnirali mikrokapsule za ugrađujemo bakteriju u obliku spora.

Kako će bakterije djelovati?

1. Aktivacija

Ugrađene spore ostaju dormantne u mikrokapsulama. Da bi ih probudili, prenijeli su gen, gerA, u bakterije i prekomjerno ga eksprimirali. Ovaj gen kodira za receptor na unutarnjoj membrani, koji može detektirati nutriente u okolišu, primjerice L-alanin, i aktivirati germinaciju i inicirati ovaj sustav kroz složene signalne puteve.

2. Rezistenca na alkalni okoliš

Prenesena su dva gena za alkalnu otpornost. 1. Ekspresija gena tupA rezultira vrstom enzima koji može promijeniti glukuronsku kiselinu i L-glutaminsku kiselinu u poliglukuronsku kiselinu i poli-γ-L-glutaminsku kiselinu. Ovi polimeri stvaraju sloj zaštitne barijere na staničnoj stijenci i neutraliziraju ekstracelularni hidroksil. 2. Drugi gen za otpornost na alkalne uvijete je nhaC. To je kodirajući gen za protonske pumpe na staničnoj membrani. Ove protonske pumpe igraju ključnu ulogu u reguliranju citoplazmatske pH vrijednosti, simultanim provođenjem vodikovih iona unutar, a natrijevih iona van stanice.

3. Proizvodnja CaCO3 i popunjavanje pukotina

Prenesli su gen za karbonsku anhidrazu u bakterije. Ovaj gen proizvodi visoko učinkovite enzime koji kataliziraju reverzibilnu reakciju hidratacije CO2 te stvaranja bikarbonata i protona. Bikarbonatni radikali će difuzirati iz stanice niz koncentracijski gradijent i spojiti se s hidroksilom i kalcijevim ionom u betonu, što dovodi do stvaranja sedimenta kalcijevog karbonata. Sada kalcijev karbonat može ispuniti mikro pukotine.

Konstrukcija plazmidnog vektora

Upotrijebili su Shuttle plazmid pP43NMK za projekt, koji se može replicirati i u Bacillus subtilis i u Escherichia coli. Unutar vektora, prvi promotor P43 je izvorna komponenta i inicira transkripciju nizvodnog kodirajuće sekvence, uključujući OF4-nhaC, C125-tupA i CA. Ovi dijelovi imaju odgovarajuće RBS i zajednički terminator rrnBTl. Drugi promotor PsspB je lociran prije genske regije gerAa. Kroz homolognu rekombinaciju/cross-over – a između gerAa regije u plazmidu i endogene gerAa sekvence na kromosomu dolazi do insercije sspB promotora uzvodno od gerA operona, što će dovesti do gerA prekomjerne ekspresije tijekom germinacije. Svi su gore navedeni dijelovi spojeni preko restrikcijskih mjesta.

Aplikacija i realizacija

Da bi potvrdili sposobnost soja WB800 za proizvodnju kalcijevog karbonata i primjenu u samopopravljanju betona, napravili su korak naprijed, uspostavljajući betonski model za razumijevanje interakcije između betona i rekombinantnog B. subtilis. Koristeći posebni materijal - mikrokristaliničnu celulozu dodali su oko 10-8 /ml endospora s glinom i naravno, L-alaninom (u prahu), koji zajedno čine sitnu ali moćnu mikrokapsulu. Zatim su ulili cement, koji je još uvijek bio u viskoznom tekućem stanju, u kalup dok cement nije dostigao 2/3 kalupa, dodali mikrokapsule te napunili kalup cementom do vrha. Nakon nekoliko dana sušenja betonskih kalupa izvadili su beton iz kalupa. Zatim su rascijepili beton na pola, otkrivajući mikrokapsule. Nakon toga su spojili dva dijela betonskog stupca zajedno ljepljivom vrpcom. Sada je na površini prisutna mikro-pukotina. Označili su ove betonske stupove i stavili ih u umjetnu morsku vodu 28 dana. Mikro-pukotine na površini su popravljene kao da nikad nisu ni postojale.

Viri

iGEM 2017 ekipa [1]