Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za izboljšanje proizvodnje šikimske kisline v E. coli
Uvod
Šikimska kislina je intermediat šikimatne poti, ki se v farmacevtski industriji uporablja kot izhodna surovina za sintezo protivirusne učinkovine oseltamivir, ta pa se uporablja za zdravljenje gripe. Iz industrijskega vidika je zato pridobivanje večjih količin šikimske kisline izredno pomembno, kar pa je mogoče doseči z izolacijo spojine iz naravnih virov, s kemijsko sintezo ali z mikrobno fermentacijo [1]. Za slednje se uporabljajo sevi E. coli, ki so gensko spremenjeni tako, da omogočajo usmeritev metabolnega fluksa v sintezo šikimske kisline. Pri tem so bili do sedaj v ospredju predvsem različni statični sistemi regulacije (izbijanje tarčnih genov, itd.) pri katerih metabolni fluks sicer usmerimo v želeno biosintezno pot, lahko pa takšne modifikacije obenem vodijo v ustavitev celične rasti zaradi blokade v sintezi esencialnih metabolitov [2]. Šikimatna pot se namreč pri šikimski kislini ne ustavi, pač pa se nadaljuje naprej do korizmata, ki je prekurzor za nastanek različnih spojin, pomembnih za rast in delovanje celic, kot so aromatske aminokisline, folna kislina, itd. [3] Reševanje tega problema je sicer možno z dodajanjem aromatskih aminokislin k minimalnemu gojišču, v katerem gojimo celice, vendar so le-te drage. Vedno bolj zato v ospredje prihajajo dinamični sistemi regulacije, ki omogočajo kontrolo nad več konkurenčnimi metabolnimi potmi, s čimer po eni strani zagotavljajo pripravo zadostne količine želenega produkta, po drugi strani pa ohranjanje viabilnosti celic.
Med dinamične sisteme regulacije sodijo različna sinteznobiološka vezja, med katerimi imajo posebno velik potencial vezja, ki temeljijo na optogenetiki – regulaciji celičnih procesov s pomočjo svetlobe. Le-ta namreč predstavlja reverzibilen vir, ki je v primerjavi s kemičnimi induktorji, ki se jih sicer uporablja za regulacijo, cenejši in celicam netoksičen, poleg tega pa lahko s spreminjanjem njegove jakosti dosežemo različno močne celične odzive [2].
Optogenetika deluje na principu na-svetlobo-odzivnih proteinov, ki ob osvetljevanju s svetlobo karakteristične valovne dolžine spremenijo svoje lastnosti. Takšen je na primer protein VIVID iz nitaste glive Neurospora crasa, ki deluje kot fotoreceptor za modro svetlobo [4]. V svoji strukturi ima vezan kofaktor FAD, ki na svetlobi tvori cisteinil-flavinski adukt, kar vodi v večje konformacijske spremembe proteina in njegovo dimerizacijo [5, 6].
Potek
Ideja raziskovalne skupine je bila, da bi s pomočjo svetlobe nadzirali delovanje encimov šikimatne poti, s čimer bi povečali proizvodnjo šikimske kisline, obenem pa zagotovili zadostno količino esencialnih metabolitov v celicah, da ne bi prišlo do zaustavitve rasti. To so dosegli z bifunkcionalnim optogenetskim stikalom, ki je bil obenem dvoslojen - vseboval je tako transkripcijske kot post-transkripcijske regulacijske enote. Prve delujejo neposredno na DNA, tako da vplivajo na prepisovanje tarčnih genov, vendar pa pri njih prihaja do zakasnjenega in nepopolnega celičnega odziva, saj nimajo vpliva na že nastale proteine. Boljšo učinkovitost se zato doseže s hkratno uporabo post-trasnkripcijskih regulacijskih enot, katerih tarča so RNA, oziroma že nastali proteini. Razgradnjo slednjih lahko npr. dosežemo preko uvedbe N- ali C-končnih razgradnih oznak (degronov), ki proteine usmerjajo v razgradnjo [2, 7].
Sam bifunkcionalni sistem so razvili po manjših korakih, sprva z reporterskim proteinom GFP:
Priprava transkripcijske regulacijske enote
Transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru transkripcije reporterskega gena s pomočjo represorja TetR. Sestavljali sta jo tako transkripcijska represijska enota (TRU), ki je bila namenjena zaustavitvi transkripcije gena za GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter transkripcijske aktivacijske enote (TAU) z nasprotnim učinkom. Obe enoti sta kot vhodno vezje vsebovali zapis za razcepljeni represor TetR, pri čemer sta bila tako N-končni kot C-končni del represorja fuzirana s proteinom VIVID, kar je omogočilo njuno nadzorovanje s pomočjo svetlobe. Izhodno vezje je v primeru TRU vsebovalo zapis za GFP pod promotorjem PTet, v primeru TAU pa zapis za LacI pod promotorjem PTet ter zapis za GFP pod promotorjem PTrc.
Pri obeh enotah sta v temi nastala N- in C-končni del razcepljenega TetR, vsak v fuziji s proteinom VIVID. Ker se slednji v temi nahaja v monomernem stanju, ni prišlo do povezave razcepljenih delov TetR, zato je bil le-ta neaktiven. V primeru TRU je zato transkripcija GFP potekala nemoteno, v primeru TAU pa je nemoteno potekala transkripcija LacI. Ta je preko vezave na operatorsko mesto na promotoju PTrc onemogočal nastanek GFP.
Ob osvetljevanju z modro svetlobo je prišlo do dimerizacije proteina VIVID, kar je vodilo v povezavo razcepljenih delov TetR in njegovo aktivacijo. V primeru TRU se je TetR vezal na operatorsko regijo promotorja PTet, zaradi česar se je zaustavilo prepisovanje GFP, v primeru TAU pa je aktivirani TetR blokiral transkripcijo LacI, zato je transkripcija GFP pričela potekati [2].
Priprava post-transkripcijske regulacijske enote
Post-transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru količine že nastalih reporterskih proteinov s pomočjo N- in C-končnih razgradnih oznak ter proteaze TEVp. Sestavljena je bila iz post-transkripcijske represijske enote (PRU), ki je bila namenjena razgradnji proteina GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter aktivacijske enote (PAU) z nasprotnim učinkom. Samo vhodno vezje je bilo pri enotah enako kot pri TRU in TAU, le da je namesto razcepljenega represorja TetR vsebovalo razcepljeno proteazo TEVp. Izhodno vezje pri PRU je bilo enako tistemu pri TRU, le da je bil zapis za GFP fuziran še z N-končnim degronom teF. Izhodno vezje pri PAU pa je vsebovalo zapis za GFP v fuziji s C-končnim degronom teLAA pod promotorjem PTet.
V temi je bila razcepljena TEVp neaktivna. Pri PRU zato do razgradnje nastalega GFP ni prišlo, saj je bil N-končni degron neizpostavljen. Ob izpostavitvi modri svetlobi je dimerizacija proteina VIVID omogočila povezavo ter aktivacijo proteaze TEVp, ki je nato preko proteolitične cepitve izpostavila N-končni degron na GFP, zaradi česar je prišlo do njegove razgradnje. Pri PAU je bil efekt nasproten. V temi je C-končna oznaka teLAA na proteinu GFP le-tega vodila v razgradnjo, ob osvetljevanju z modro svetlobo pa je aktivirana proteaza TEVp oznako odstranila, zato se GFP ni razgradil [2].
Združitev enot v dvoslojno stikalo
Združitev regulacijskih enot v dvoslojno optogenetsko stikalo je omogočalo hkratno kontrolo nad transkripcijo gena za GFP in regulacijo količine že nastalega proteina. Zgrajeno je bilo iz transkripcijskega in post-transkripcijskega represijskega sistema (TPRS) ter aktivacijskega sistema (TPAS). Oba sta vsebovala tako vhodna vezja transkripcijske kot post-transkripcijske regulacijske enote, razlikovala pa sta se po izhodnih vezjih:
- TPRS je vseboval enakega kot PRU. Ob osvetljevanju celic z modro svetlobo je aktivirani represor TetR zaustavil transkripcijo gena za GFP, ki se je nahajal pod promotorjem PTet, aktivirana TEVp pa je s proteolitično cepitvijo izpostavila N-končni degron teF na GFP, zato se je nivo GFP znižal.
- Izhodno vezje TPAS je bilo podobno izhodnemu vezju TAU, le da je bil zapis za LacI prisoten v N-končni fuziji z degronom teF, zapis za GFP pa v C-končni fuziji z degronom DAS. Ob osvetljevanju z modro svetlobo je tako aktivirani TetR zaustavil transkripcijo LacI, aktivirana TEVp pa je s cepitvijo izpostavila N-končni degron, zato se je količina LacI znižala, transkripcija GFP pa je lahko potekala. GFP je sicer nastajal v C-končni fuziji z degronom DAS, ki bi protein načeloma vodil v razgradnjo, vendar je proteaza TEVp oznako odcepila.
Priprava bifunkcionalnega optogenetskega stikala za regulacijo proizvodnje šikimske kisline
Vključitev na novo razvitih sistemov TPRS in TPAS v šikimatno pot je omogočila nadzor nad delovanjem encimov v le-tej s pomočjo modre svetlobe. Vhodni vezji z razcepljenima TetR in TEVp sta pri tem ostali enaki, v izhodnih vezjih pa je prišlo do zamenjave GFP z encimi šikimatne poti:
- V izhodnem vezju sistema TPRS je zapis za GFP nadomestil zapis za šikimat kinazo (AroK), ki šikimsko kislino pretvarja v šikimat 3-fosfat [8]. V temi, ko je AroK nastajala, je zato šikimatna pot potekala vse do aromatskih aminokislin, zaradi česar so celice neovirano rastle. Na svetlobi pa je transkripcija gena zaradi vezave TetR prenehala potekati, že nastali encimi AroK pa so se razgradili zaradi izpostavitve degronske oznake teF na N-koncu encima zaradi delovanja TEVp [2].
- V izhodnem vezju sistema TPAS sta zapis za GFP zamenjala zapisa za 3-deoksi-D-arabinoheptulozonat 7-fosfat (DAHP) sintazo (AroG) ter 3-dehidrokinat (DHQ) sintazo (AroB), ki sta pomembna pri sami sintezi šikimske kisline [2, 8]. V temi je bil nastanek encimov onemogočen zaradi delovanja represorja LacI, nekontrolirano nastali encimi pa so se razgradili zaradi C-končne degronske oznake DAS. Ob osvetljevanju je prišlo do razgradnje represorja LacI in zaustavitve njegovega nastanka, zato je transkripcija genov za AroG in AroB pričela potekati, nastala encima pa se nista razgradila, saj je aktivirana TEVp odstranila njuno degronsko oznako.
Sistema TPRS in TPAS sta torej zagotovila bifunkcionalnost samega stikala, pri čemer je TPRS omogočal neovirano rast celic v temi, TPAS pa je ob osvetljevanju z modro svetlobo metabolni fluks preusmeril v proizvodnjo šikimske kisline, kar je povečalo njen izplen in zmanjšalo količino stranskih produktov.
Vključitev bifunkcionalnega stikala v šasijo E. coli S5 je omogočila nastanek 4,2 g/L šikimske kisline v minimalnem gojišču NBS z dodatkom 20 g/L glukoze, kar je 1,6-krat več kot v celicah brez sinteznobiološkega vezja. Kot optimalni pogoji za gojenje celic so se izkazali temperatura 37 °C, koncentracija glukoze 40 g/L ter pričetek osvetljevanja po 24-urnem gojenju celic v temi. V takšnih pogojih so celice v 72 urah v 5 litrskem bioreaktorju proizvedle 35 g/L šikimske kisline, kar je največji titer šikimske kisline v minimalnem gojišču do zdaj [2].
Viri in literatura
[1] A. Ramazani, A. Shahkarami, Fatemeh Zarei, S. Rezayati, A. Rezaei, A. Bodaghi, L. Youseftabar-Miri: Shikimic acid from staranise (Illicium verum Hook): Extraction, purification and determination. Eurasian Chem. Commun. 2021, 3(7), str. 452–460.
[2] I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in E. coli. Biotechnol. Biofuels Bioprod. 2022, 15(13), str. 1–14.
[3] V. Tzin, G. Galili: New Insights into the shikimate and aromatic amino acids biosynthesis pathways in plants. Mol. Plant 2010, 3(6), str. 956–972.
[4] J. M. Hurley, C. H. Chen, J. J. Loros, J. C. Dunlap: Light-inducible system for tunable protein expression in neurospora crassa. G3 Genes, Genomes, Genet. 2012, 2(10), str. 1207–1212.
[5] A. T. Vaidya, C. H. Chen, J. C. Dunlap, J. J. Loros, B. R. Crane: Structure of a light-activated LOV protein dimer that regulates transcription. Sci. Signal. 2011, 4(184).
[6] B. D. Zoltowski, B. R. Crane: Light activation of the LOV protein vivid generates a rapidly exchanging dimer. Biochemistry 2008, 47(27), str. 7012–7019.
[7] A. Stikāne: Degrons, http://2014.igem.org/Team:Edinburgh/project/degrons (pridobljeno 23. 4. 2022).
[8] D. F. Liu, G. M. Ai, Q. X. Zheng, C. Liu, C. Y. Jiang, L. X. Liu, B. Zhang, Y. M. Liu, C. Yang, S. J. Liu: Metabolic flux responses to genetic modification for shikimic acid production by Bacillus subtilis strains. Microb. Cell Fact. 2014, 13(1), str. 1–11.
