Biobalon

Stanford-Brown iGEM 2016: Bioballon [1]

Uvod

Skupina Stanford-Brown je želela s svojim projektom prispevati k raziskovanju planetov. Transport tovora v vesolje je zelo finančno potratno. Namreč, pri zadnjem vesoljskem letu z letalom Dragon, ki ga je podjetje SpaceX poslalo na mednarodno vesoljsko postajo, je cena poslanega tovora znašala okoli 18200 $ na kilogram. S pomočjo sintezne biologije bi lahko na Mars namesto robustnih materialov poslali mikrobe, ki bi proizvajali komponente za izgradnjo različnih orodij in struktur. Uporabno orodje, ki ga je skupina želela izdelati, je biobalon, s katerim bi raziskovali lastnosti atmosfere na Marsu. Z manipulacijo bakterij so želeli izdelati polimere za izgradnjo membrane balona in z algami proizvajati vodik, ki bi napolnil balon. Biosenzor na biobalonu bi bil biološki termometer pritrjen na membrano.

Biomembrane

Funkcionalnost balona določa tako zmožnost dviga kot tudi vzdržljivost membrane. Vzdržati mora sile raztezanja in kompresije pri nizkih tlakih, kot tudi temperaturne spremembe. Za vzdrževanje plina je skupina želela izvesti biološko proizvodnjo tako umetnih kot naravnih membran, ki bi zadrževale vodik. Za fleksibilnost membrane so izbrali lateks; elastin in kolagen zaradi viskoelastičnih lastnosti kot npr. v steni aorte; polimer kevlar za ojačanje membrane proti stresu iz p-akrilamidnih vlaken in za odpornost na sevanje bakterijski melanin.

Kolagen

Ker je sinteza človeškega kolagena zelo zahtevna, so ga poskusili nadomestiti z mimetiki kolagena izdelanih v bakterijah. Na podlagi predhodnih raziskav so osnovali kolagenske konstrukte, ki so vsebovali domene za njihovo trimerizacijo, prečno povezovanje in podaljševanje. Na N-koncu mimetika so bakterijskemu kolagenu dodali domeno, ki omogoča tvorbo zvite vijačnice homotrimerov in se ohrani pri 90 °C [1]. Za heterotrimerizacijo so to domeno zamenjali s heterotrimerno domeno [2]. Za prečno povezovanje, ki je ključno za mehanske lastnosti kolagena, so uporabili eksona 21 in 23 človeškega tropoelastina. Skupaj so sestavili tudi konstrukte treh zaporednih heterotrimernih domen z bakterijskim kolagenom s prečno-vezavnimi domenami. Nalaganje konstruktov s prečno-vezavnimi domenami bi omogočila nastajanje lepljivih koncev in s tem tvorbo kolagenskih vlaken.

UV zaščita

Raziskali so absorpcijske lastnosti melanina in razvili nov mehanizem za vključevanje melanina v materiale. S pomočjo obstoječega dela MI Chavez-Bejar [3] so želeli povečati proizvodnjo L-tirozina v Escherichia coli, iz katerega nastaja dopakvinon z encimom tirozinazo. Dopakvinon nato preko oksidacije in polimerizacije tvori evmelanin. Endogena pot za nastajanje L-tirozina se začne s pretvorbo fosfoenolpiruvične kisline (PEP) in eritroza-4-fosfata (E4P) v DAHP, kar katalizira DAHP-sintaza, ki deluje po principu negativne povratne zanke - inhibicije s produktom. Z usmerjeno mutagenezo so ustvarili DAHP-sintazo AroG z zamenjavami aminokislin Pro150Lev in Lev175Asp. Ti zamenjavi povzročita rezistenco encima na inhibicijo s produktom. Zaporedje so vstavili v vektor pSB1C3 s konstitativnim promotorjem, močnim RBS mestom in dvojnim terminatorskim mestom. Transformirali so T7 ekspresijske celice E. coli. Iskali so tudi način, s katerim bi melanin lahko vključili direktno v materiale in ne le pripeli na balon. Želeli so ustvariti vezavne proteine, ki bi vezali velike količine melanina, tako da bi ustvarili dekapeptide 4B4 in heptapeptide 4D z afiniteto do melanina. Ker so genski konstrukt z dolgo verigo ponovitev zahtevni za manipulacijo, so manjšim fragmentom DNA, ki so kodirali za posamezni deka ali hepta peptid, dodali podaljške s šestimi nukleotidi enoverižne DNA na 3' in 5' koncu [4]. Po ligaciji so uspeli ustvariti segmente s 30 ponovljenimi fragmenti. Iz gela so uspeli izolirati 4D segmente in jih nato vstavili v vektor pSB1C3 s konstitativnim promotorjem in močnim RBS mestom. Dodali so tudi domeno za vezavo celuloze (CBD angl. cellulose binding domain), oznake FLAG, lumino in histag za karakterizacijo in izolacijo proteinov. Za preverjanje učinkovitosti so proteine nato inkubirali skupaj z melaninom v etanolu in nato nanesli na celulozni papir, kjer so se tudi uspešno pritrdili skupaj z melaninom.

Lateks

Z metabolnim inženirstvom E. coli so uspeli sintetizirati primarni gradnik lateksa cis-1,4-poliizopren preko manipulacije endogene poti MEP/DOXP in transformacije genov za proizvodnjo gume iz drevesa Hevea brasiliensis. Poleg uspešne modifikacije organizma, je bila proizvodnja izvedena v enostavnem mediju in v velikem donosu. Sintezo cis-1,4-poliizoprena v drevesih, kot je H. brasiliensis, omogoča encim cis-prenil-transferaza. Ta povezuje posamezne izoprenske monomere v polimer. Primarno uporabljen monomer v cis-1,4-poliizoprenu je izopentil pirofosfat (IPP), ki je tudi izomer bolj reaktivnega dimetil alil pirofosfata (DMAPP). Encim za svoje delovanje potrebuje Mg2+ ione in koencim SRPP (angl. small rubber particle protein) [5]. Sinteza IPP in DMAPP v E. coli obstaja kot endogena metabolna pot - MEP/DOXP pot. Gre za 6 stopenjski proces pretvorbe glukoze, ki se začne s pretvorbo piruvata in gliceraldehid-3-fosfata (G3P). Za premik ravnotežja v smer produkta so pot optimizirali. Ker je prva stopnja tista, ki omejuje hitrost celotne MEP/DOXP poti, so za optimizacijo izvedli prekomerno izražanje DXP-sintaze. Za kontrolo izražanja so gen za DXP-sintazo vstavili v vektor pod inducibilnim IPTG promotorjem. Dodali so še oznake FLAG, tetracistein in heksahistidin za izolacijo in karakterizacijo, ter dve terminatorski mesti. Ker je bil konstrukt prevelik, da bi ga sintetizirali v enem delu, so uporabili metodo Gibsonovega sestavljanja (angl. Gibson assembly) za vstavljanje v linearni plazmid pSB1A3 z rezistenco na ampicilin. S plazmidom so transformirali T7 E. coli ekspresijske celice. Z dodajanjem IPTG v medij je bil donos IPP in DMAPP večji kot v odsotnosti indukcije izražanja DXP-sintaze. Za izdelavo polimera so izbrali prenil-transferazi HRT1 in HRT2 in gena vstavili v plazmid pSB1C3. Ker prenil-transferazi za delovanje potrebujeta kofaktor SRPP, so zaporedje za SRPP vključili v isti operon, pred genoma za HRT1 in HRT2 za večje izražanje. Operon je pod kontrolo IPTG inducibilnim promotorjem. Za čiščenje in karakterizacijo so dodali oznake FLAG, tretracistein in heksahistidin, ter s plazmidom transformirali T7 ekspresijske celice. Združevanje plazmidov v enem gostitelju so omogočili z različnimi rezistenčnimi markerji na obeh plazmidih. Alternativno so gen za DXS-sintazo vstavili še v vektor pUC19, saj bi med vektorjema pSB1C3 in pSB1A3, ki imata enako mesto ori, lahko prišlo do homologne rekombinacije v isti gostujoči celici. Za indukcijo proizvodnje lateksa so gojišču dodali IPTG, glukozo in MgSO4. Po izražanju so lateks ekstrahirali iz 350 ml medija in celic. Po centrifugiranju so pelet s celicami lizirali v nepolarnem topilu kloroformu, ki raztaplja poliizopren [6]. Po filtraciji so kloroformu dodali metanol za precipitacijo lateksa in pridobili 1,5 ml belega polimera. Za test karakterizacije so polimer posušili in zažgali, kar je povzročilo nastajanje vonja po zažgani gumi in črnega gostega dima, ki je značilen za gorečo gumo. Ekstrakt je bil tudi kompresibilen in elastičen.

Biosenzor: merjenje temperature

Z meritvami termostabilnosti kromoproteinov so dokazali, da se različni kromoproteini odzivajo na različne temperaturne spremembe z izgubo ali menjavo barve. Te lastnosti kromoproteinov so jim omogočile izgradnjo biosenzorja za zaznavanje temperaturnih sprememb. Najprej so test termostabilnosti izvedli v zaprtem sistemu. V PCR-epice so dodali celični lizat in EDTA. PCR-epice so nato segreli za 5 minut pri začetni temperaturi 40 °C, nato odstranili iz termostata, fotografirali in vrnili v termostat za nadaljnjih 5 min na 5 °C višji temperaturi. Proces so ponavljali do 100 °C. Kromoproteini so izgubili barvo pri določenih temperaturah. Z rezultati eksperimenta so izdelali prototip termometra izbranih skupin kromoproteinov. S testiranjem termostabilnosti v odprtem sistemu so želeli preveriti vpliv vode na stabilnost kromoproteinov. Osnovna struktura kromoproteinov sta beta-sodček in kromofor, ki ga sodček stabilizira. Obliko beta-sodčka stabilizirajo vodne molekule preko interakcij s stranskimi verigami aminokislin, zato so ključne pri ohranjanju njegove strukture. Pri visoki temperaturi se vodne molekule sprostijo iz sodčka, zato se sodček sesede in kromofor ni več stabiliziran dovolj, da bi povzročil obarvanost [7]. Testirali so 12 kromoproteinov na enakomerno segreti petrijevki, ter jih nato rehidrirali. Nekateri kromoproteini so ponovno pridobili barvo, vendar drugačno od začetne. Test so izvedli še z liofilizatorjem, pri konstanti temperaturi, kjer so kromoproteini po rehidraciji pridobili prvotno barvo. Prototip z izoliranim kromoproteinom AE Blue z domeno CBD so testirali tudi na terenu. Prototip so zaščitili še z UV-zaščitnim steklom. Balon s prototipom je dosegel višino 3 km, kjer je protein spremenil svojo barvo iz modre v vijolično. Sprememba barve se je ohranila še 6 ur.

Proizvodnja plina

Za plin, ki bi hipotetično napolnil biobalon, so izbrali vodik in za proizvajalca plina algo Chlamydomonas reinhardtii. Zelene alge lahko proizvajajo vodik namesto kisika v procesu biofotolize, kjer encim hidrogenaza katalizira reakcijo med fotosistemom II in ferodoksinom. Pri fotosistemu II poteče cepitev vode, kar ustvari elektrone, ki v ferodoksinu skupaj z vodikovimi protoni v mediju ustvarijo H2. Uporabili so optimiziran protokol za proizvodnjo H2 v C. reinhardtii [8], pri katerem lahko alge proizvajajo 2 ml H2 na 10 ml kulture alg po 96 urah. Ključno pri protokolu je pomanjkanje žvepla v gojišču. Stekleničko z algami v gojišču BG-11 so za 12 h izpostavili svetlobi pri 21 W/m2 in jo nato ovili v aluminijasto folijo. Po nekaj dneh so proizvajanje vodika dokazali s preprostim pokalnim testom, pri čemer so ustju stekleničke približali gorečo vžigalico. V kontaktu s vžigalico je počilo in ugasnilo plamen, kar je dokazalo prisotnost vodika.

Zaključek

Rdeča nit projekta je raziskovanje zunajzemeljskega sveta s pomočjo biobalona, ki pa posamezne podprojekte ne omejuje tudi za druge namene. Nov način proizvodnje lateksa lahko pripomore k globalni proizvodnji gume, saj sintetična proizvodnja z leti narašča v ceni in škoduje okolju, zmanjševanje gozdov pa zmanjšuje letni donos zasajenih dreves za proizvodnjo naravne gume.

Viri

1. Yamauchi M, Sricholpech M (2012) Lysine post-translational modifications of collagen. Essays Biochem. 52: 113–133.

2. Nautiyal S, Woolfson DN, King DS, Alber T. Biochemistry 1995;34:11645−11651

3. María I Chávez-Béjar, Metabolic engineering of Escherichia coli to optimize melanin synthesis from glucose. Microbial Cell Factories, 2013 Nov 13;12:108.

4. Fujishima, K., Venter, C., Wang, K., Ferreira, R., & Rothschild, L. (2015). An overhang-based DNA block shuffling method for creating a customized random library. Sci. Rep., 5, 9740.

5. Epping, J. et al. A rubber transferase activator is necessary for natural rubber biosynthesis in dandelion. NPLANTS Nature Plants 1, 15048 (2015).

6. Liengprayoon, S., Bonfils, F., Sainte-Beuve, J., Sriroth, K., Dubreucq, E. and Vaysse, L. (2008), Development of a new procedure for lipid extraction from Hevea brasiliensis natural rubber. Eur. J. Lipid Sci. Technol., 110: 563–569.

7. Langan, P.s., D.w. Close, L. Coates, R.c. Rocha, K. Ghosh, C. Kiss, G. Waldo, J. Freyer, A. Kovalevsky, and A.r.m. Bradbury. "Corrigendum to “Evolution and Characterization of a New Reversibly Photoswitching Chromogenic Protein, Dathail” [J. Mol. Biol., 428, (2016), 1776–89]." Journal of Molecular Biology 428.20 (2016): 4244.

8. Jo, J., Lee, D., & Park, J. (2006). Modeling and Optimization of Photosynthetic Hydrogen Gas Production by Green Alga Chlamydomonas reinhardtii in Sulfur-Deprived Circumstance. Biotechnol. Prog., 22(2), 431-437.