Biološke naprave in vezja za pripravo pametnih cepiv na osnovi RNA

Z razvojem sintezne biologije so se pojavile nove možnosti uporabe regulacije izražanja genov. V ta namen so se na začetku uporabljale predvsem DNA molekule. V mojem članku pa so se odločili, da nam predstavijo regulacijske mehanizme na osnovi RNA, ker menijo da so le ti primernejši za uporabo kot zdravila oziroma cepiva pri človeku.

Na mRNA se v evkariontih veže veliko število proteinov večina sodeluje pri izvedbi translacije. Nekateri izmed njih pa vezavo inhibirajo translacijo in so zato primerni za regulacijo tega procesa. L7Ae je protein, ki ga najdemo v arhejah in se veže na K-obrat RNA. Ugotovili so, da prisotnost K-obrata v 5´-UTR mRNA proteina, lahko deluje kot stikalo. Prevajanje proteina je vključeno, če encim L7Ae ni prisoten in izključeno, ko se L7Ae veže na mRNA, saj s tem ovira vezavo za translacijo potrebnih proteinov.

Pri bakteriofagih MS2 so ugotovili, da se plaščni protein, ko se ga izrazi dovolj, veže v dimer in z vezavo na mRNA inhibira translacijo replikaze. Opazili so, da če tarčno zaporedje za MS2-CP damo v 5´-UTR željene mRNA ta sterično ovira in s tem inhibira translacijo.

Tetraciklinski represor se v sintezni biologiji uporablja za reguliranje prepisovanja genov. V kombinaciji z aptameri pa je primeren tudi za regulacijo translacije. Z metodo SELEX lahko najdemo aptamere, ki se vežejo nanj. Če tega vstavimo v 5´-UTR regijo mRNA bo vezava tetR inhibirala prevajanje. Ponovno aktivacijo translacije dobimo tako, da dodamo tetraciklinski derivat, ki sprosti tetR iz aptamera.

Encimi PUF pa so evkariontski proteini, ki so vpleteni v številne procese kot so diferenciacija, regulacija celičnega cikla, produciranje spomina. RNA vezavna domena vsebuje 8 α-heličnih ponovitev, vsak izmed njih prepozna en nukleotid RNA tako lahko naredimo različne PUF proteine, ki prepoznajo različno sekvenco. V študijah so naredili fuzije PUF z različnimi proteini, kot so splicing represorji/aktivatorji, RNA endonukleaze, deadenilaze, poliA-polimeraze, eIF4. Podobno kot ti, se na RNA specifično vežejo tudi PPR proteini, vendar pa prepoznavni kod še ni povsem razvozlan.

Za razliko od RBP se za regulacijo translacije lahko uporabijo tudi male molekule, ki pri določenih sekvencah RNA izzovejo spremembo konformacije. Takim odsekom RNA rečemo aptameri. Za iskanje le teh se uporablja metoda SELEX. Vendar pa je uporaba te metode za namen razvoja cepiva nekoliko pomanjkljiva, saj poteka izbor in vitro in ne in vivo. Večina deluje na principu hibridizacije regij, ki so pomembe pri translaciji (AUG, RBS, IRES). Hibridizirana mesta se ob vezavi male molekule razdrejo in postanejo dostopna za RBP, ki tako lahko sprožijo translacijo. Poseben primer uporabe aptamerov je ribosomski preskok. Ob vezavi male molekule se dela RNA med katerima je aptamer dovolj približata, da ribosom iz enega dela, kjer je prej potekla translacija iz sORF, preskoči na drug in nadaljuje branje ter translacijo na dORF. Z aptameri lahko reguliramo tudi splicing pre-mRNA, če je ta vstavljen na 3´ss ali 5´ss mesto.

Ribocimi so katalitično aktivne RNA molekule, ki cepijo sami sebe. Sestavljeni so iz RNA, ki se poveže v tri stebla. Steblo dve ribocima nadomestimo z aptamerom in tako lahko reguliramo aktivnost ribocimov. Tako lahko, če jih vstavimo enega za drugim, pridobimo različna logična vrata.

Tudi interferenčna RNA sodeluje pri regulaciji translacije v celici. Procesiranje različnih oblik RNA v siRNA je lahko mesto regulacije utišanja genov z siRNA. Aptamer lahko vključimo v zanko, katero od shRNA odcepi Dicer. Konformacijska sprememba aptamera ob vezavi male molekule prepreči vezavo Dicerja in prepreči utišanje gena. Sterično oviranje lahko dosežemo z prej omenjenim k-zavojem na katerega se veže L7Ae in prepreči vtišanje. V 5´konec lahko vstavimo tudi aptacim, ki bi se ob signalu male molekule sam odcepi od shRNA in pride do procesiranja siRNA in utišanja gena. Utišanje lahko reguliramo tudi s transfekcijo z oligonukleotidom, ki se veže na mesto cepitve Drosha encima. Z napovedovanjem so odkrili, da se aromatična spojina benzimidazol veže na miR-96, ki jo prekomerno izražajo tumorske celice in s tem prepreči procesiranje. Za napovedovanje RNA struktur na katere se vežejo male molekule se uporabljata dva načina analize. Eden je z agaroznimi mikromrežami z imobilizirano malo molekulo v katere dodamo različne kratke zanke in izberemo tiste, ki so se vezale nanjo. Analiziramo jih s programom RNA-PSP. Druga metoda je StARTS, ki preko sekvence napoveduje interakcije različnih zank z malo molekulo. Nenazadnje pa se inhibicija utišanja genov lahko izvede tudi z RNA spužvami, ki so molekule za katere zapis je vstavljen kot transgen in vsebuje močan konstitutivni promotor in vsebuje številna, po vrsti razporejena tarčna mesta za miRNA. Izražena spužva polovi miRNA za katere vsebuje tarčna mesta.

Naslednja stopnja pri izdelavi aktivnega proteina so posttranslacijske modifikacije pri katerih najdemo tudi številna orodja za regulacijo. Lahko naredimo fuzijo željenega proteina z destabilizacijsko domeno, ki je tarča ubikvitina oziroma proteosoma. Destabilizacijska domena mora vsebovati še vezavno mesto za malo molekulo, ki povzroči konformacijske spremembe domene. Te konformacijske spremembe zamaskirajo destabilizacijsko domeno tako, da ni prepoznavna za razgrajevalne proteine. V odsotnosti male molekule pa se fuzijskemu proteinu močno skrajša razpolovni čas. Obratno kot DD deluje z ligandom inducirana degradacijska domena, ki kot že ime pove v prisotnosti male molekule pospeši razgradnjo fuzijskega proteina. Prav tako sta domeni uporabni za regulacijo razpolovnega časa RBP, ki pa jih lahko uporabimo za regulacijo transkripcije kot sem omenila že prej.

Za senzorje lahko uporabimo fuzijo z G-proteini, ki zaznajo male molekule kot je dopamin. Vendar pa bi bilo to težko vstaviti v RNA vezja, saj ni kompatibilen, ker je senzor protein in ne RNA. Za senzorje v RNA vezjih lahko vzamemo tarčne sekvence za miRNA, ki jo vstavimo v 3´-UTR. Nekatere miRNA se različno izražajo v različnih celicah. Tam kjer so prisotne se vežejo na tarče in aktivirajo senzor. Uporabimo lahko tudi mRNA senzor, ki deluje na principu izpodrivanja verig v siRNA. Novo nastali siRNA dupleks se naloži na RISK in utiša tarčno RNA. RNA dele lahko med seboj sestavimo v RNA vezja, če je le izhodni signal ene naprave enak vhodnemu sledeče naprave. Niso pa še sestavili vezja, ki bi bil sestavljen popolnoma iz RNA za uporabo v sesalskih celicah. V neki študiji so sestavili sesalski bioračunalnik iz L7Ae in MS2 naprav, ki je lahko izvedel računanje z uporabo NOT, AND, N-IMPLY, XOR logičnih vrat. Poleg translacijske regulacije z L7Ae in MS2 je sistem vseboval tudi transkripcijsko regulacijo.

mRNA in replikacijske RNA so dokazano dobra platforma za cepiva. Tudi RNA naprave kot so aptameri, aptacimi so primerni za imunomodulacijo, celično specifično ciljanje antigenov, in prezentacijo de novo antigenov.

Torej priprava cepiva na osnovi RNA za enkratno uporabo bi bila sledeča: uporabili bi replikon z dvema subgenomskima promotorjema. Eden od njih bi izražal fuzijski protein RBP in DD, drugi pa RBP vezavni motiv pred antigenom. Vezje bi delovalo tako, da bi mala molekula, ki bi jo zaužili oralno, povzročila zamaskiranje DD in s tem podaljšan razpolovni čas RBP, ki bi inhibiral tvorbo antigena. Z uporabo konstruktov z več antigeni pa lahko naredimo tudi cepivo za raka.

Že nekaj časa je minilo odkar se je pojavila sintezna biologija. Zbiranje vseh možnih in poznanih naprav omogoča uresničenje še tako različnih idej, saj jih lahko sestavljamo v zahtevnejša vezja in sisteme. Trenutno smo napredovali do sistemov, ki so uporabni v sesalskih celicah pa tudi do uporabe primernejših RNA vezji. Tako lahko že načrtujemo pametna cepiva, nekatera so bila tudi že uporabljena na celičnih kulturah. Uporabnost pa se bo izkazala, ko bodo poskusi v laboratorijih prešli na uporabo v realnem svetu.