Biomaterial za privzemanje urana iz okolja - "žetveni stroj" urana
iGEM 2016 Peking izvorna stran: http://2016.igem.org/Team:Peking
Skupina iz Pekinga je svoj iGEM 2016 projekt poimenovala Uranium reaper oz »žetveni stroj urana«. Želeli so pripraviti biomaterial, ki bi odstranjeval uran iz okolja.
Uvod
Uran je radioaktivna težka kovina. Predstavlja nevarnost tako za okolje, zaradi radioaktivnosti in toksičnosti, kot tudi za človeka, saj se ob izpostavljenosti akumulira v tkivu in vpliva na delovanje mnogih organov. Največ urana uhaja v okolje v bližini jedrskih elektrarn in rudarskih središč. Zaradi negativnih učinkov na okolje in človeka, se morajo odpadne vode iz jedrskih elektrarn čistiti. Obstoječe metode za odstranjevanje nevarnega urana kot so ionska izmenjava, reverzna osmoza in fitoremediacija, pa so žal drage, kompleksne in nizkoučinkovite. Prav zato si ekipa želi zasnovati funkcionalen biomaterial iz več proteinskih modulov s svojo funkcijo. Material bi proizvajale bakterije, polimerna mreža pa bi se tvorila spontano s prečnim povezovanjem proteinov. Z dodatkom super uranil-vezavnega proteina (SUP) bi bil tak polimerni material zmožen vezati uranilne ione. Omogočili bi tudi enostavno odstranjevanje iz onesnažene vode s pomočjo streptavidin-biotin vezave.
Prečno povezovanje proteinov
Prečno povezani peptidi tvorijo polimerne mreže, ki imajo večjo kontaktno površino in so bolj mehansko trdni. Prav tako se lahko enostavno regenerirajo in so zato tudi bolj okolju prijazni. Za nastanek polimerne mreže je pogoj, da monomeri kljub različnim okoljskim dejavnikim kažejo visoko afiniteto en do drugega. Ekipa iz Pekinga je izhajala iz fibronektin-vezavnega proteina FbaB bakterije Streptococcus pyogenes, ki ima avtokatalitično domeno CnaB. Ta je sposobna spontane tvorbe izopeptidne vezi med aminokislinskima ostankoma Lys in Asp. Raziskovalci so to avtokatalitično domeno CnaB ločili na dva fragmenta in tako dobili krajši C-terminalni peptid SpyTag in daljši N-terminalni protein SpyCatcher. Zaradi okrajšav bomo SpyTag imenovali A in SpyCatcher B. Z povezavo SpyTag in SpyCatcher z elastinu podobnim proteinom (ELP) so dosegli nastanek fuzijskih monomerov, ki so sposobni tridimenzionalne polimerizacije, pri čemer nastanejo polimerne mreže z visoko stopnjo prečnih povezav. Z eksperimenti so ugotovili, da optimalno polimerizacijo dosežejo, če uporabijo monomere z tremi SpyTag zaporedji s funkcionalno domeno super uranyl protein (SUP) in monomere, ki vsebujejo tri SpyCatcher fragmente. Uspešno so pripravili konstrukte SpyTag-SpyTag-SpyTag-SUP (3A-SUP), SpyTag-SpyTag-SpyTag-Msa (3A-mSA) in SpyCatcher- SpyCatcher- SpyCatcher (3B). Proteine so pridobili z lizo bakterijskih celic ali sekrecijo v medij.
Adsorpcija urana
Uran se v anaerobnih pogojih večinoma nahaja v obliki uranilnega kationa UO22+. Super uranil-vezavni protein (SUP) je načrtovan tako, da njegova struktura omogoča čimbolj specifično vezavo na uranilne katione. Raziskave kažejo, da je SUP termodinamsko zelo stabilen in ima veliko afiniteto ter selektivnost na uranilne katione. Glede na to, da je SUP domena del fuzijskega proteina 3A-SUP, je bilo potrebno testirati vpliv dodatnih modulov (3A) in polimerizacije na funkcijo SUP domene.
Metoda
Zmešali so ustrezen volumen 3/4/6A-SUP in 3B ter inkubirali 1 uro, da je prišlo do nastanka polimerne mreže. Proteinom so dodali raztopino uranilnih ionov v TBS pufru. Reakcijsko mešanico so takoj prenesli v centrifugirke s filtrom in centrifugirali, tako da so proteini ostali na filtru. Filtratom so izmerili koncentracijo uranilnih ionov.
Rezultati
Adsorbcija uranilnih ionov pri različnih fuzijskih proteinih
Že sama raztopina 3A-SUP je pokazala zelo dobro adsorpcijo uranilnih ionov (87%), prečno povezani 3A-SUP in 3B pa so vezali kar 96% uranilnih ionov. Poskusili so tudi z različnimi drugimi fuzijskimi proteini, ki vsebujejo več SpyTag ponovitev. Rezultati so bili dobri, vendar pa je še vedno najbolj učinkovit 3A-SUP+3B sistem.
Adsorbcija uranilnih ionov pri različnih pogojih
Dokazali so uspešno adsorpcijo uranilnih ionov v TBS pufru, vendar pa so želeli testirati učinkovitost v bolj naravnih pogojih. Tako so uporabili vodo iz jezera in umetno ustvarjeno morsko vodo. Adsorpcijska kapaciteta je v primeru sveže vode padla na 67%, v primeru morske vode pa je bila 83%. Sklepali so, da so proteini manj stabilni v pogojih z nižjimi koncentraciji soli.
Adsorbcija uranilnih ionov v pogojih z majhno koncentracijo urana
Želeli so tudi poskusiti, kakšna bi bila adsorpcija pri zelo nizkih koncentracijah urana. Ugotovili so, da pri 6000 krat večji koncentraciji proteinov še vedno pride do adsorbcije uranilnih ionov (48% v TBS pufru in 35% v umetno ustvarjeni morski vodi). Rezultati torej nakazujejo, da bi bil polimerni biomaterial lahko uporaben ne le pri primerih hudega onesnaženja z uranom, vendar tudi pri čiščenju morske vode izven območij hudega onesnaženja.
Čiščenje biomateriala iz okolja
Ko enkrat nastane polimeren material in le-ta veže uranilne ione, želimo biomaterial odstraniti iz okolja in ga regenerirati. Ekipa iz Pekinga je uporabila sistem streptavidina in biotina, ki imata zelo veliko afiniteto en do drugega. Odločili so se za monomerni Streptavidin (mSA), saj nativni streptavidin tetramerizira, kar bi v našem biomaterialu lahko oviralo dostop 4 molekulam biotina in bi bilo čiščenje manj učinkovito. Konstrukt monomernega streptavidina so vzeli iz knjižnjice biokock, njegova značilnost pa je, da ima med vsemi monomernimi streptavidini največjo afiniteto do biotina ter večjo stabilnost in topnost kot drugi, kar je zelo pomembno v težkih pogojih okoljske onesnaženosti. Vsaka od 4 neodvisnih monomernih molekul lahko veže eno biotinsko molekulo. Pripravili so konstrukt rekombinantnega proteina, ki vsebuje 3 SpyTag zaporedja in mSA modul. S tem ko so vključili 3 SpyTag zaporedja, je mSA modul vključen v nastanek polimerne mreže. Biotin se nahaja na magnetnih kroglicah. Ko z magnetom imobiliziramo omenjene magnetne kroglice, te zaradi povezave med streptavidinom in biotinom s seboj pritegnjejo celoten polimerni biomaterial z vezanimi uranilnimi ioni.
Rezultati
Učinkovitost vezave 3A-mSA monomerov na magnetne kroglice
Za merjenje učinkovitosti vezave 3A-mSA monomerov na magnetne kroglice so uporabili 2 metodi. Pri SDS page so nanesli samo raztopino 3A-mSA in raztopino 3A-mSA z dodanimi magnetnimi kroglicami ter 3A (brez mSA) brez magnetnih kroglic in 3A z magnetnimi kroglicami. Rezultati so pokazali da se 3A-mSA učinkovito veže na magnetne kroglice prekrite z biotinom, medtem ko se 3A ne veže in ostane v raztopini. Izmerili so tudi koncentracijo proteinov v raztopini. Ko so 3A-mSA dodali magnetne kroglice z biotinom in izvedli čiščenje, je v raztopini ostalo le 14% 3A-mSA. Preostalih 86% se je učinkovito odstranilo iz raztopine. Če protein ne vsebuje mSA modula pa v raztopini po čiščenju ostane 78% 3A. S tem so dokazali, da je čiščenje z magnetnimi kroglicami z biotinom učinkovito in da je vezavna kapaciteta zelo dobra.
Učinkovitost vezave polimerne mreže na magnetne kroglice
Za preverjanje učinkovitosti čiščenja polimerne mreže so zmešali 3 vrste monomerov: 3A-mSA, 3A-mRFP in 3B ter raztopino pustili stati 1 uro, da se tvori polimerna mreža. Nato so nastalo polimerno mrežo inkubirali z magnetnimi kroglicami prekritimi z biotinom in naredili SDS page monomerov z kroglicami in brez magnetnih kroglic. Izmerili so tudi koncentracijo preostalih proteinov po inkubaciji z magnetnimi kroglicami. Pri SDS page so pred dodatkom magnetnih kroglic z biotinom lepo vidne lise, ki prikazujejo različno velike polimerne mreže, po dodatki magnetnih kroglic pa lis skoraj ni, kar nakazuje uspešno čiščenje. Pri analizi proteinov so ugotovili, da po 1 urni inkubaciji z magnetnimi kroglicami v raztopini ostane le 22% nevezanih proteinov. Iz teh rezultatov so ugotovili, da mSA modul v polimerni mreži ostane funkcionalen in da je čiščenje učinkovito.
Sekrecija
Proteine lahko pridobimo z lizo celic, vendar pa je skupina iz Pekinga želela ustvariti sistem, pri katerim bi se rekombinantni proteini izločali v medij. Tako so pripravili knjižnico signalnih peptidov in naredili mnogo poskusov za optimizacijo sekrecije proteinov. Poskuse so izvajali na E.coli in B.subtilis.
E.coli
Za sintezo proteinov se v molekularni biotehnologiji največkrat uporablja bakterija E.coli. Izbrali so vektor pET28a s T7 promotorjem in RBS. Ker ima E.coli zunanjo membrano, je lahko izvencelična sekrecija proteinov težavna, zato so se odločili uvesti gen kil. Kil je bakteriocin sproščujoči protein (BRP), ki povzroči permeabilizacijo zunanje membrane, kar bi olajšalo sekrecijo proteinov v medij. Problem pa je, da previsoko izražanje kil gena vodi do celične smrti. Tako so izbrali srednje močen promotor J23117. Vključili so tudi lac operator, kar je omogočalo inducibilno izražanje kil gena. Ta se je izražal le ob aktivaciji z IPTG.
B. subtilis
B. subtilis je gram pozitivna bakterija, zato nima zunanje membrane, kar ji omogoča sekrecijo proteinov direktno v medij. Izbrali so pBES vektor. Za povečanje ekspresije in sekrecije so poskusili 2 promotorja – PaprE in P43.
Knjižnica signalnih peptidov
Ekipa se je odločila pripraviti knjižnjico signalnih peptidov, saj zaradi različnih fuzijskih proteinov, ki še niso tako dobro opisani, niso znali izbrati primernega signalnega peptida. Tako so izbrali 4 signalne peptide za E.coli (OmpA, LTIIb, PhoA, PelB) in 5 za B. subtilis (ImdA, NprE, SacB, YifA, LipA). Naredili so konstrukte z 3A-SUP, 3A-mSA, 3A-mRFP in 3B. Konstruktom so dodali tudi His-tag in FlAsH-tag za lažjo detekcijo sekrecijskih proteinov.
Rezultati
Učinkovitost sekrecije pri E.coli
Sekrecija proteina 3A-RFP v medij ni bila uspešna pri nobenem signalnem peptidu, prav tako ni bila uspešna sekrecija 3A-SUP s signalnim peptidom PelB. Pri ostalih proteinih in signalnih peptidih so v mediju zaznali željeni protein, vendar učinkovitost sekrecije med signalnimi peptidi variira. Ugotovili so, da je najboljša sekrecija z signalnima peptidoma OmpA in LtIIb. Zanimivo je tudi, da je koekspresija s Kil proteinom vodila do zmanjšane učinkovitosti sekrecije. Potrebna bi bila optimizacija promotorja.
Učinkovitost sekrecije pri B.subtilis
Pri B. subtilis ni bilo zaznati nobenega proteina v mediju, niti v citoplazmi, kljub uporabi različnih signalnih peptidov. Skupina je sklepala, da se verjetno proteini v B. subtilisu sploh ne izražajo, zato so hitro opustili poskuse z B. subtilis.
Viri
- http://2016.igem.org/Team:Peking, dostopno december 2016
- https://en.wikipedia.org/wiki/Uranium_in_the_environment, dostopno december 2016
