Biosinteza indiga v E. coli s CYP102A iz Streptomyces cattleya

Indigo, oziroma 2,2'-bis(2,3-dihidro-3-oksoindoliliden), je organska spojina značilne modre barve. Gre za naravno barvilo, ki so ga za barvanje tkanin uporabljali že pred 6000 leti. Pridobivali so ga iz rastlin roda Indigofera, ki rastejo predvsem v tropih. Večina danes uporabljenega indiga je sintetična (npr. Baeyer-Drewsonova sinteza), saj je poraba izredna, iz ekoloških razlogov pa iščemo tudi alternative, ki temeljijo na biotransformaciji in encimskih modifikacijah. Največ indiga se porabi za barvanje jeansa in podobnih tkanin, pa tudi za obarvanje živil.

CYP102A_scat

Citokrom P450 monooksigenaze (CYP) so naddružina hem-tiolatnih proteinov, ki katalizirajo vključevanje kisikovih atomov v substrate. Ena najbolj znanih družin CYP je družina CYP102A (encimi CYP102-A1 BM3, A2, A3,...), njen substrat so dolgoverižne maščobne kisline, ki jih hidroksilirajo. V to skupino spada tudi CYP102A_scat, ki je ostalim encimom zelo podobna, ima pa tudi posebne motive, kot sta hem-vezavna domena in dioksid vezavna domena.

CYP102A_scat, za uspešno katalizo reakcije nastanka indiga ne potrebuje modifikacij. Njegovo zaporedje je zelo podobno ostalim zaporedjem iz skupine, za razliko od ostalih pa po indukciji z IPTG v LB mediju nastaja indigo.

Eksperiment

Iz seva Streptomyces cattleya so izolirali gen za monooksigenazo imenovan CYP102A_scat, ga nespremenjenega klonirali v pET-28a(+) in rekombinantni protein izrazili v sevu E. coli BL21. Sintezo indiga sprožimo z dodatkom IPTG, ustavimo pa z dodatkom DMSO in vorteksiranjem. Indigo se v ločenih fazah nahaja v fazi z DMSO. Vzorce so nato analizirali z uporabo različnih spektroskopskih tehnik.

Analiza zaporedij in produkta CYP102A_scat

Primerjali so podobnost CYP102A_scat z nekaterimi predstavniki družine CYP102A. Ugotovili so, da je zaporedje CYP102A _scat visoko identično ostalim zaporedjem predstavnikov skupine, najvišje ujemanje ima z encimom CYP102A1 BM3 (41,3 %), najnižje pa z CYP102A5 (39,1 %).

Rekombinantne E. coli so proizvajale zadovoljive količine produkta. Na podlagi SDS-PAGE so ugotovili, da je protein velik 101,2 kDa. Ugotovili so tudi, da ima produkt absorbcijski vrh v UV/vis spektru pri 450 nm, kar je značilno za CYP.

Opazili so še, da medij s celicami spreminja barvo in sicer s časom postaja vedno bolj moder, kar so pripisali nastajanju CYP102A_scat. Da so to lahko potrdili, so eksperiment opravili večkrat, pri čemer so morala zagotoviti, da obarvanost ni posledica kontaminacije. Enoznačno so to potrdili po tem, ko so modri pigment indetificirali s strukturnimi analizami in uporabo 1H NMR spektroskopije.

Strukturna identifikacija »neznanega« pigmenta

Raziskovalci so zmešali enaka volumna medija in DMSO in po centrifugiranju ločili modri supernatant, ki so ga analizirali s TLC, HPLC in 1H NMR spektroskopijo. Za primerjavo rezultatov so kot standard uporabili sintetični indigo. Produkt, ki so ga ločili s TLC je pokazal eno liso (indigo), med tem, ko je standard dal dve lisi (indigo in indirubin). Lisi za indigo se popolnoma ujemata. Izvedli so tudi ločitev s HPLC in dobili enak vrh, kot pri standardu.

1H NMR spekter je dal vrhove pri δ 6,551 ppm, δ 6,990 ppm in δ 7,496, gre za protone aromatskega obroča. Pri δ 10,465 je bil viden vrh za proton C-NH. Tudi te podatki se ujemajo s standardom.

Z GC/MS so pokazali še, da je razmerje m/z 262, kar se ujema z molsko maso sintetičnega indiga.

Optimizacija proizvodnje indiga z dodajanjem sintetičnih prekurzorjev

Ugotavljali so tudi odvisnost nastajanja indiga od koncentracije glukoze, kot dodatnega vira ogljika. V ta namen so uporabili tri medije z različnmi koncentracijami glukoze. Pokazali so, da višja koncentracija glukoze povzroči znižanje koncentracije nastalega indiga, kar je v nasprotju s pričakovanji.

Opazovali so tudi učinek dodatka indola, ki je prekurzor triptofana in nastane iz glukoze. Z uporabo različnih koncentracij indola so pokazali, da višja koncentracija indola pomeni več nastalega indiga. Preučili so še učinek dodatka kombinacije indola in L-triptofana, pri čemer je bila koncentracija triptofana konstantna, koncentracijo indola pa so spreminjali. Produkt je najhitreje nastajal, ko je bila koncentracija indola 20 µM, koncentracija triptofana pa 0,2 mM in sicer je takrat nastalo 3,8±0,1 g/L indiga.

Viri

H. J. Kim »et al«. »Biosynthesis of indigo in Escherichia coli expressing self-sufficient CYP102A from Streptomyces cattleya.« Dyes and Pigments; vol. 140; maj 2017.

https://en.wikipedia.org/wiki/Indigo, [citirano: 20.4.2017].