Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells & SCNT
UVOD
Metoda jedrnega prenosa t.i. somatic cell nuclear transfer (SCNT) je pogosto uporabljena tehnika za kloniranje prašičev. Slabost te metode je njena nizka učinkovitost (ok. 1-3%). Na učinkovitost vpliva tudi sposobnost reprogramiranja donorske celice do pluripotentne. Kot donorske celice večinoma uporabljajo končno diferencirane fibroblasti, ki se pogosto nepravilno reprogramirajo, kar je eden od vzrokov za tako nizko učinkovitost metode. Oocite lažje reprogramirajo genom nediferenciranih ali manj diferenciranih celic kot genom končno diferenciranih celic. Ker embrionalne matične celice (ESC) prašičev niso dostopne, se uporabljajo multipotentne mezenhimske matične celice (MSC). Avtorji članka Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Are an Attractive Donor Cell Type for Production of Cloned Pigs As Well As Genetically Modified Cloned Pigs by Somatic Cell Nuclear Transfer Li in sod. so v raziskavi primerjali sposobnost razvoja kloniranih prašičjih embrijev, nastalih iz MSC ali fibroblastov, po implantaciji in vivo.
IZOLACIJA MSC IN FIBROBLASTOV, DIFERENCIACIJA MSC IN FACS
MSC so izolirali iz kostnega mozga, fibroblasti pa iz uhlja prašiča. MSC so se v določenem gojišču uspele diferencirati v osteocite oz. adipocite, kar potrjuje, da so bile izolirane MSC multipotentne. Preko metode sortiranja celic s fluorescenčno aktivacijo (FACS) so analizirali, kateri označevalci so bili vezani na površino teh celic. S tem so potrdili, da so izolirali MSC.
TRANSFEKCIJA MSC
Izvedli so transfekcijo MSC z lipofektaminom in lineariziranim plazmidom pPSP-xynB, ki je sestavljen iz gena za ksilanazo iz glive, katerega izražanje je uravnano s promotorjem, specifičnim za žleze slinavke, in iz selekcijskega markerja, ki omogoča odpornost proti G418 in je med dvema mestoma LoxP, kar omogoča, da se kasneje odstrani iz genoma transgenega prašiča. Po transfekciji so celice gojili v gojišču z G418 , pri čemer so se ohranile samo tiste MSC, ki so vsebovale vnešen plazmid. Za potrditev, da se je plazmid vgradil v genom, so MSC, odpornim na G418, izolirali genomsko DNA in s PCR pomnožili gen za ksilanazo. Nato so PCR produkt sekvencirali, da bi potrdili, da se je dobljeno nukleotidno zaporedje ujemalo s tistim od vstavljenega gena.
DOLOČANJE ZAPOREDJA Z UPORABO BISULFITA
Da bi primerjali vzorec metilacije imprintiranih genov, genov, ki vplivajo na pluripotentnost in ponavljajoče DNA v genomu MSC in fibroblastov, so genomsko DNA izolirali, nato denaturirali in obdelali z natrijevim bisulfitom, ki je pretvoril vse nemetilirane citozine v uracile. S PCR so pomnožili te dele genoma in jih sekvencirali. MSC in fibroblasti so se razlikovale v nivoju metilacije imprintiranih genov in ponavljajoče DNA.
SCNT
Za kloniranje prašičev so uporabili metodo SCNT, pri čemer so izolirali oocite in jim odstranili prvo polarno telo in okoliško citoplazmo, posledično vse kromosome. Nato so fibroblasti ali MSC mikroinjicirali v oocite. Potem so kompleks oocita-donorska celica gojili in ga aktivirali z dvema električnima pulzoma, pri čemer sta se citoplazmi teh dveh celic zlili (fuzija).
Sledilo je gojenje nastalih embrijev, pri čemer so spremljali sposobnost njihovega razvoja in vitro. Po implantaciji pa so to spremljali in vivo. Šlo je za statistično značilno večje št. živorojenih kloniranih prašičev glede na št. prenesenih embrijev in posledično večjo učinkovitost kloniranja prašičev pri uporabi MSC kot donorskih celic v primerjavi z uporabo fibroblastov.
Podoben postopek so izvedli tudi z embriji, nastalimi iz genetsko modificiranih MSC.
PRENOS SOUTHERN IN RT-PCR
Da bi ugotovili, kateri prašiči so transgeni, so izolirali genomsko DNA iz repa in izvedli prenos Southern. 2 prašiča od 4 živorojenih kloniranih iz genetsko spremenjenih MSC sta bila transgena. Da pa bi ugotovili, v katerih organih se vstavljeni gen izraža, so po 1 letu pri izbranih tkivih izvedli RT-PCR. Nato so PCR produkte sekvencirali, da so potrdili, da gre za ta gen. Dokazali so, da je bil specifično izražen v žlezah slinavkah.
ZAKLJUČEK
Glede na to, da je bilo št. celic v blastocisti statistično značilno večje v primeru uporabe MSC kot donorskih celic v primerjavi z uporabo fibroblastov, in da se je nivo metilacije imprintiranih genov in ponavljajoče DNA razlikoval med MSC in fibroblastmi, so Li in sod. sklepali, da št. celic v blastocisti in vzorec metilacije v tem delu genoma pomembno vplivata na normalen razvoj embrija. Slednje je bilo v skladu z rezultati že narejenih raziskav. Dokazali so, da je večja učinkovitost kloniranja in vivo ob uporabi MSC kot donorskih celic v primerjavi z uporabo fibroblastov in da se genetsko spremenjene MSC lahko uporabijo kot donorske celice pri SCNT za nastanek kloniranih transgenih prašičev.
Članek:
Li, Z., He, X., Chen, L., Shi, J., Zhou, R., Xu, W., Liu, D., Wu, Z. (2013). Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Are an Attractive Donor Cell Type for Production of Cloned Pigs As Well As Genetically Modified Cloned Pigs by Somatic Cell Nuclear Transfer. Cellular Reprogramming. 15, 459-470. (http://online.liebertpub.com/doi/pdf/10.1089/cell.2013.0010)
