CAPTURE: Boj proti okužbam s Pseudomonas aeruginosa z nosilci protimikrobnih peptidov

CAPTURE je iGEM projekt ekipe Freiburg iz Nemčije iz leta 2024. Z njim so osvojili zlato medaljo, nagrado za najboljši projekt v kategoriji nalezljive bolezni, ter se uvrstili med najboljših 10 podiplomskih projektov.

MOTIVACIJA

Okužbe z bakterijami odpornimi na antibiotike so svetovni problem, ki letno povzročijo preko 1 270 000 smrti (2021). Eden glavnih igralcev v bolnišničnih, na antibiotike odpornih okužbah je Pseudomonas aeruginosa. Gre za Gram-negativno bakterijo, ki uspeva v okoljih z nizko koncentracijo kisika – med drugim tudi v vodnih virih, kar predstavlja velik problem v bolnišnjičem okolju. Pseudomonas aeruginosa ima širok repertuar mehanizmov, ki ji omogočajo odpornost na antibiotike. Med drugim formacijo biofilmov, kar podaljšuje njeno obstojnost tudi na površinah. Je pogost vzrok pljučnih obolenj vključno s pljučnico in sepso, ki se lahko prenaša tudi z ventilatorji za predihavanje.

IZBIRA MODELNEGA ORGANIZMA

Ker je Pseudomonas aeruginosa klasificiran kot organizem z drugo stopnjo biološkega tveganja raziskave skupina ni morala narediti na tem organizmu. Po obsežni bioinformatski analizi so kot svoj modelni organizem izbrali Psevdomonas fluorescens – soroden nepatogen organizem, ki uporablja podobne mehanizme za formacijo biofilmov. Kot 2 ključna elementa, indentificirana po genetski podobnosti in vključenosti v formacijo biofilma so izpostavili peI operon in transkripcijski faktor FleQ. Za določene analize (določanje idealne lokalizacije končnega produkta) so kot modelni organizem uporabili bakterijo E. coli seva BL21(DE3) – gram negativno bakterijo (izbrana zaradi dosptopnosti in strukture celične stene.

PROTIMIKROBNI PEPTIDI (AMP-ji)

5-100 aminokislin dolgi peptidi – evolucijsko ohranjena komponenta prirojenega imunskega odziva – so peptidi bogati s pozitivno nabitimi aminokislinami, ki so sposobni uničiti tako gram pozitivne kot negativne bakterije. Primaren mehanizem delovanja AMP-jev je vplivanje na integriteto bakterijske membrane preko peptidno-lipidnih interakcij. Alternativni mehanizem delovanja pa imajo AMP-ji ki vstopijo v celico in preko vezave na DNA, RNA in komponente ključne za formacijo celične stene ter vodijo v apoptozo in zmanjšanje nastajanja biofilma. Delovanje AMP-jev je usmerjeno na več tarč znotraj ene celice, kar zmanjša vrjetnost, da bo bakterija razvila rezistenco. Zdravljenje z AMP-ji je tudi združljivo z zdravljenjem z antibiotiki.

Izbrana AMP-ja

Sushi S1

Naravni AMP iz mangrovovega podkovnjaka (Carcinoscorpius rotundicauda). AMP z 34 aminokislinami, ki so mu dokazali močno protimikrobno delovanje proti gramnegativnim bakterijam, sploh P. Aureginosi, preko interference z integriteto celične membrane. Pozitivno nabit AMP se veže na negativno površino grem-negativnih bakterij (predvsem na lipidne A komponente lipopolisaharidov. Ko se nabere v membrani interagira s fosfolipidi in preko teh hidrofobnih interakcij povzroči luknje v membrani in s tem vodi v apoptozo.

D-CONGA-Q7

Sintetični AMP, v celoti sestavljen iz D-aminokislin kar poveča njegovo obstojnost zaradi neobčutljivosti na običajne peptidaze. V okviru projekta so ga izražali z L-enantiomerno obliko aminokislin.

TESTIRANJE DELOVANJA AMP-JEV

Projekt CAPTURE temelji na želji, da bi obšli nestabilnost AMP-jev z izražanjem le teh v ciljnih organizmih samih. To so dosegli z vnosom plazmida specifičnega za bakterije iz rodu Pseudomonas v ciljnih organizmih. Da bi bil izraženi AMP kar se da učinkovit so najprej testirali pomen lokalizacije končnega produkta na samo delovanje. Zato so E. coli transformirali s plazmidi na osnovi pET-22(b)+ plazmida z vnešenim zapisom za Sushi S1 pod periplazemskim lokalizacijskim signalom pelB, ekstracelularnim lokalizacijskim signalom HSTII in brez lokalizacijskega signala. Rezultati merjenja celične rasti so pokazali, da ima konstrukt z ekstracelularnim signalom najbolj negativen vpliv na rast bakterij. Nepričakovano je imel dokaj močan inhibitoren vpliv tudi prazen induciran plazmid (primerljivo s konstrukti s Sushi S1). Poleg tega analiza rasti na ploščah pokaže največji inhibiciji pri praznem plazmidu in konstruktu brez lokalizacijskega signala. To skupaj močno omaje zanesljivost njihovih rezultatov. Ko so pomerili moč inhibicije rasti bakterij na plošči izbranih dveh, že izoliranih AMP-jev, so dobili negativne rezultate (inhibicija ni bila opazna), kar se ne ujema z njihovimi ugotovitvami iz literature. Sklepali so, da gre za nizko obstojnost AMP-jev in potencialno razgradnjo med skladiščenjem. Konstrukt HSTII-Sushi so nato inducirali pri dveh temperaturah: 18°C in 30°C. Inhibicija je bila opazna le pri temperaturi 30°C. Kot kontrolo so tokrat uporabili plazmid z zapisom za mCherry (ne prazen plazmid), kar tudi v pogoju kjer so izražanje inducirali ni povročilo inhibicije. Analiza izražanja konstrukta HSTII-Sushi-6xHis pokaže, da se le ta izraža do 4-6 ur po indukciji, nato pa produkt po Western prenosu ni več viden in inhibicija rasti ni več opazna (po 24h je rast celic enaka kot v kontrolnih pogojih). Preverili so tudi delovanje konstrukta z AMP-jem CONGA-Q7, ki je pokazal primerljivo inhibicijo AMP-ju Sushi S1 v prvih 7 urah. Presenetljivo pa je enako inhibicijo pokazala tudi negativna kontrola – konstrukt s peptidom Imitate. Zaradi tega izpostavijo možnost, da inhibicija ni odvisna od aminokislinskega zporedja a le od fizikalno kemijskih lastnosti peptida.

Za delo v E. coli je bil uporabljen plazmid na osnovi vektorja pET-22b(+), z začetkom replikacije ColE1, genom za rezistenco AmpR, vnešeni zapisi pa so bili pod močnim promotorjem T7 reguliranim z lacO operonom.

SESTAVA KONČNEGA PLAZMIDA

Končni plazmid, za izražanje v Psevdomonas fluorescens je bil sestavljen na osnovi vektorja pUCP18, ki vsebuje mesto začetka prepisovanja ki izvira iz P. Aeroginosa pRO1600 oriV, mesto začetka prepisovanja za učinkovito pomnoževanje plazmida v E. coli ColE1 in gen za rezistenco na kanamicin. Dodali so mutiran promotor pel, ki je specifičen za bakterije rodu Pseudomonas (izvira prav iz P. Aeruginosa), ki je bil spemenjen do mere, da je odvisen le od transkripcijskega markerja FleQ (prisotno v bakterijah rodu Pseudomonas – regilara nastajanje biofilma), ne pa od sekundarnega regularorja c-di-GMP. Vstavljen je bil tudi močan terminaror LUZ7 T50. Kot glavni igralec je bil seveda vstavljen zapis za Sushi S1, tokrat vezan na lokalizacijski signal phaZ – ekstracelularni signal specifičen za Psevdomonas fluorescens.

DOSTAVNI SISTEM

Kot dostavo plazmida do celis psevdomonas so tekom projekta preizkusili 2 sistema: lipidne nano nosilce in membranske vezikle.

Lipidni nano nosilci

Preizkusili so 2 tipa lipidnih nano nosilcev. Orjaške unilamelarne nosilce (GUV), ki so jih v nadaljevanju razbili na velike unilamelarne nosilce (LUV) in na lipidne nanodelce (LNP). Za oba tipa so testirali upešnost metode za produkcijo nosilcev in pri tem optimizirali razmerje med uporabljenimi lipidi. Odločili so se za uporabo palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoholinom (POPC) zaradi njegove dostopnosti in pogoste uporabe kot modelnega lipida v biofizikalnih študijah, kationskega lipida 2-dioleoil-3-trimetilamonijev propan (DOTAP) za izboljšanje enkapsulacije negativno nabite plazmidne DNA in optimizacijo fuzije z bakterijskimi membranami in ps nevtralnega pomožnega lipida 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (DOPE) za povečanje stabilnosti veziklov. Za oba tipa nosilcev so otimizirali razmerje med danimi lipidi. V nadaljevanju so preverili uspešnost enkapsulizacije plazmida (in spet primerjali uspešnost z razmerjem med lipidnimi komponentami). Uspešno so dosegli končno enkapsulizacijo v obeh sistemih, a se je izkazalo da uspešnost malenkost boljša z malenkost LUV. Za povrhu so razvili še svojo metodo za testiranje uspešnosti sprejemanja plazmidov v vezikle.

Za test fuzije s celicami P. auruginosa so v lipidno plast inkomponirali še glikosfingolipid Gb3, ki omogoča interakcijo z LecA prisotno na površini P. auruginose. Z nosilci ki so izhajali iz GOV so naleteli na tehnične težave med tem ko so z LUV opazili potencialno fuzijo pod konfokalnim mikroskopom.

Preverili so tudi toksičnost obeh sistemov na sesalsne pljučne celice in dokazali da LUV v nizkih (medicinsko relavantnih) koncentracijah niso pokazali nobee toksičnosti, LNP pa so rahlo toksičnost pokazali le pri večjih koncentracijah.

Membranski vezikli (OMV)

Sferični nosilci, ki izhajajo iz celične stene gram negativnih bakterij. Uporabili so poseben modificiran sev E. coli omp8, zaradi svoje sposobnosti hipervezikulacije in dobre prezentacije željenih proteinov na površini. Da bi dosegli specifično vezavo na tarčne celice so uporabili modificiran protein zunanje membrane iz enega od prejšnjih iGem projektov eCPX in fuzirali s peptidom SpyTag. Poleg tega so izrazili tudi SpyCather, fuziran z ligandom receptorja na repu P. Aeruginosa ki naj bi omogočil končno specifično vezavo. Testirali so 3 promotorje da so določili kateri rezultira v najvišji koncentraciji želenega proteina na veziklih in se odločili za konstitutivni promotor Laclq. Izražanje OMV-jev in njihovo izolacijo so dokazali z metodo dinamečnega sipanja svetlobe (DLS). Žal pa pri tem postopku niso uspeli dokazati ne enkapsulizacije DNK, niti transformacije posredovane z OMV.