CampyLOCATOR - detekcija bakterije Campylobacter jejuni pri zastrupitvah s hrano

Povzeto po projektu iGEM skupine Glasgow

UVOD

Bakterija Campylobacter jejuni povzroča črevesno nalezljivo bolezen. Po podatkih svetovne zdravstvene organizacije (WHO) se eden od desetih ljudi letno okužbi s to bakterijo. Campylobacter jejuni je gram negativna bakterija, optimalni pogoji za njeno rast in razmnoževanje so pri temperaturi 30-45 °C. Najpogostejši vzrok za okužbo z bakterijo je slabo toplotno obdelano perutninsko meso, nepasterizirano mleko in uživanje nefiltrirane vode. Inkubacijska doba pri človeku traja od dva do pet dni. Okužba poteka kot akutna črevesna okužba brez trajnih posledic. Simptomi okužbe so diareja, povišana telesna temperatura, krči v trebuhu, bruhanje, glavobol, bolečine v mišicah in sklepih. Trenutni diagnostični sistemi za okužbo s to vrsto bakterije so časovno zamudni, dragi in nedostopni za vsakodnevno uporabo. Diagnostika poteka z analizo vzorca blata ali z izolacijo organizma. Prisotnost bakterije potrdijo z gojenjem v selektivnem mediju v prisotnosti antibiotika pri temperaturi 42 °C, možna je tudi analiza s fazno-kontrastno mikroskopijo ali s testi po Gramu. Uporabne so tudi druge metode (ELISA, PCR, …).

iGEM ekipa iz Glasgowa je zato s pomočjo sintezne biologije predstavila biosenzor za detekcijo prisotnosti bakterije Campylobacter jejuni v vzorcih.

»IN« LOGIČNA VRATA

Senzor so zasnovali na podlagi sistema dvojnega vnosa (zmanjšanje deleža lažno pozitivnih rezultatov). Izbrali so si dve molekuli, ki sta značilni za bakterijo Campylobacter jejuni. Ksiluloza je prisotna na površini bakterije in hkrati za ostale bakterije ni značilna (omogočena selektivnost). Poleg ksiluloze je za bakterije značilna molekula tudi avtoinduktor-2 (AI-2), ki je odgovoren za recikliranje S-adenozila-L-metionina (SAM). V primeru prisotnosti obeh molekul, bi se pojavil reporterski signal oz. fluorescenca, ki bi bila posledica transkripcije in nastajanja zelenega fluorescenčnega proteina (GFP).

Koncept »in« logičnih vrat so testirali s pomočjo deljenega zapisa za protein GFP in deljenega zapisa za RNA polimerazo iz bakteriofaga T7. Oba zapisa so razdelili na C-konec in N-konec ter oba zapisa vstavili v plazmida pSB1C (en vektor s promotorjem Ptet, drug vektor s promotorjem lacI). Transformirali so celice E. coli in v prisotnosti aTc in IPTG merili fluorescenco. Pričakovanih rezultatov niso uspeli pridobiti, slabe rezultate so pripisali napakam med sekvenciranjem DNA (ob načrtovanju konstruktov), in »nesrečnem« izboru zapisa za promotor.

KSILULOZA

Kot senzor za zaznavanje prisotnosti ksiluloze so želeli izkoristiti mehanizem delovanja manitol regulatornega proteina. V primeru prisotnosti poliolnega sladkorja, se manitol regulatorni protein (MtlR) veže na sladkor in aktivira transkripcijo gena mtlE in ostalih genov, ki sodelujejo pri metabolizmu sladkorjev. Če sladkorji niso prisotni, transkripcija ne poteka. Uporabili so regulatorni (pSB13C) in reporterski (pSB3K3) plazmid. Regulatorni plazmid je vseboval zapis za promotor Ptet, RBS, gen mtlR (iz organizma P. fluorescens), mesto ori in zapis za odpornost proti kloramfenikolu. Trije reporterski plazmidi so vsebovali zapis za promotor PmtlE, tri različno močne RBS, protein GFP, mesto ori in zapis za odpornost proti kanamicinu. Transformirali so celice E. coli in merili fluorescenco. Vsak reporterski plazmid so testirali z vsakim sladkorjem (manitol, sorbitol, sukroza, ksiloza, riboza, fruktoza), testirali so tudi vse kombinacije regulatornega in reporterskih plazmidov. Ekipa je v nasprotju s pričakovanji dobila pozitivne rezultate v prisotnosti riboze in sorbitola, predvidevali so, da je vzrok v uporabi različnih organizmov (uporabili so E. coli, namesto P. fluorescens, ki je bil uporabljen v članku na katerega so se sklicevali). Predpostavili so tudi možnost prisotnosti samostojega regulatornega sistema pri E. coli, ki povzroča sintezo proteina mtlR in lažno pozitivne rezultate. Predlagali so izbijanje gena, ki omogoča samostojni regulatorni sistem.

Drugi primerni mehanizem je delovanje regulatornega proteina AraC, ki je sposoben zaznavati L-arabinozo. AraC se po vezavi na L-arabinozo veže na operatorska zaporedja na promotorju PBAD in aktivira transkripcijo genov. Če bi izvedli mutagenezo ostankov, ki se nahajajo v ligand vezavnem žepu proteina AraC, bi omogočili vezavo ksiluloze namesto L-arabinoze in pojav proteina GFP. Ekipa ksiluloze ni imela na voljo, zaradi previsoke cene produkta, zato so pogosto uporabljali ksilozo (ksiluloza je prvi razgradni produkt ksiloze). Izvedli so mutagenezo ostankov na mestih 8, 24, 80 in 82 v zapisu za protein AraC. Ponovno so načrtali regulatorni in reporterski plazmid, transformirali dve vrsti celic E. coli (DH5α in DS941 celice, ki nimajo kromosomalne kopije araC). Celice so gojili v prisotnosti arabinoze, ksiluloze in dekanala ter ponovno dobili fluorescenčne signale kjer jih niso pričakovali. Signale so pripisali popuščanju promotorja in spontanim mutacijam zapisa za protein AraC. V nekaterih primerih kombinacije plazmidov in pogojem jim je mutageneza uspela in kljub prisotnosti arabinoze GFP ni nastajal.

AVTOINDUKTOR-2

Protein LsrR se veže na promotor LsrA (PlsrA) in povzroči represijo gena. V prisotnosti AI-2 se ta veže na protein LsrR in prepreči vezavo proteina na PlsrA. Sestavili so biokocko z zapisom za PlsrA, RBS in protein GFP. Če je v vzorcu prisoten AI-2, bi potekla transkripcija gena za GFP in pojavila bi se fluorescenca. Transformirali so dve vrsti celic (E. coli DS941 in DH5α). Pričakovana je bila višja flourescenca pri celicah DS941, ker celice samostojno proizvajajo AI-2. Zaradi časovnih omejitev testov niso mogli izvajati do konca. Ponovno rezultati niso bili v skladu s pričakovanji, zato so predlagali nadaljnja testiranja konstrukta. Predlagali so uporabo očiščenega AI-2 (visoka cena, 400 dolarjev za 5 mg AI-2) in podaljšan čas inkubacije celic v prisotnosti AI-2.

BIOSENZOR

Prvotna ideja biosenzorja je temeljila na mehanizmu vnosa vzorca v kapsulo s kislo raztopino, ki bi odstranila ksilulozo iz polisaharidne kapsule bakterije. Raztopino bi segreli s pomočjo električnega vezja (ksiluloza je občutljiva na povišano temperaturo) in jo s pomočjo črpalke pognali po napravi. Raztopina bi prehajala skozi ultrafiltracijsko membrano, kjer bi se zaustavili odvečni delci oz. nečistoče. V področje detekcije bi tako prešla samo ksiluloza in ostale majhne molekule. V prvi mešalni komori bi se nahajala bazična snov (tris-acetatni pufer) kjer bi v stiku s kislo raztopino potekla nevtralizacija in tako preprečila poškodbo celic E. coli. Druga mešalna komora bi vsebovala raztopino glukoze, ki bi jo celice E. coli porabljale v svojem metabolizmu namesto ksiluloze, ki bi bila prisotna v vzorcu. V območju detekcije bi se nahajale celice E. coli kjer bi v primeru prisotnosti ksiluloze in AI-2 potekla transkripcija in nastajal bi GFP. Zaznavali bi emisijo svetlobe, ki jo oddajajo celice. Med zasnovo senzorja so opredelili številne napake kot so izpostavljenosti uporabnika potencialno škodljivim substancam, uporaba velikih volumnov, ki zmanjšajo možnost detekcije in veliko korakov, kar pomeni večjo možnost napak.

Končna oblika biosenzorja je vsebovala vatirano palčko za zbiranje vzorca, ki je pritrjena na brizgo z 1 % ocetno kislino v TEA pufru. S pomočjo brizge vzorec potisnemo skupaj z ocetno kislino v napravo. Raztopina preide procesni del, kjer se vzorec segreje do 100 °C, sledi nevtralizacija v komori kjer se nahaja tris-acetatni pufer in merjenje uspešnosti nevtralizacije s pomočjo pH lističev. Naslednja komora vsebuje glukozni prah, ki se raztopi v vzorcu. Zadnja komora je detekcijska komora kjer se nahajajo celice E. coli na filter papirju, ki je prevlečen s 7,5 % poliakrilamidnim gelom. Poliakrilamidni gel preprečuje uhajanje bakterij v okolje in hkrati dovoljuje interakcijo z vodotopno ksilulozo.

Ekipa je izvedla tudi eksperimente kjer so uporabljali celice bakterije Bacillus subtilis. Bakterija zaradi tvorbe endospor prenaša širši spekter različnih pogojev in bi bili zato primerni za uporabo v biosenzorju.

ZAKLJUČEK

Celotni prototip biosenzorja je ekipa sestavila tudi iz delov, ki so jih pridobili s pomočjo 3D tiskanja. Celoten biosenzor naj bi trenutno temeljil le na vizualni detekciji nastajanja GFP, kar bi lahko predstavljalo velik problem. Predpostavili so, da bi v primeru izboljšave vseh sistemov bila možna detekcija s pomočjo pametnih telefonov ali drugih pripomočkov. Celoten projekt temelji na odlični ideji in zasnovi, a bi bilo potrebnih še veliko izboljšav, tako v korakih sintezne biologije, mutageneze in sami funkcionalnosti biosenzorja.

VIRI

- iGEM ekipa Glasgow
- Campylobacter jejuni
- Infekcije z bakterijo Campylobacter jejuni