CoBiota

CoBiota je probiotik, ki bi zniževal ravni holesterola v telesu z njegovo pretvorbo v koprostanol. To temelji na tem, da se koprostanol ne absorbira v črevesju in se lahko tako pretvorjeni holesterol izloči iz telesa. Študentski projekt je v okviru tekmovanja iGEM 2022, ki ga je pripravila skupina desetih študentov iz Univerze v McGill, Kanada [1][2]. Več podrobnosti si lahko ogledate na njihovi spletni strani projekta https://2022.igem.wiki/mcgill/.

Problem

32 % smrti po svetu je posledica bolezni srca in ožilja. Cardiovaskularne bolezni (CVD) so eden izmed vodilnih vzrokov smrti po vsem svetu in eden glavnih dejavnikov tveganja za razvoj tovrstnih bolezni je visok holesterol. Za zniževanje holesterola so bili razviti številni učinkoviti terapevtiki, vendar kljub temu te bolezni še vedno prevladujejo [2]. Zakaj? Zdravljenje se običajno začne šele ko ima bolnik že znake bolezni ali že obstaja veliko tveganje za pojav bolezni. Uživanje zdravil preventivno bi verjetno koristilo, vendar je malo verjetno da bodo mladi in zdravi ljudje jemali zdravilo, če ni predpisano iz strani zdravnika. Probiotiki bi lahko bili rešitev.

Načrt projekta

Zasnovati je bilo potrebno probiotik, ki bi izpolnjeval tri ključne pogoje:

• Imeti sposobnost absorbirati holesterol,
• Kodirati encime, ki skupaj pretvorijo holesterol v koprostanol,
• Morajo biti varni, znosni in morajo preživeti pot skozi telo do črevesja.

Za tarčno območje so si izbrali črevesjem, ker se tam metabolizem holesterola malo ustavi. Večina holesterola se sintetizira v jetrih in se nato prenese do tankega črevesa. Hkrati pa se tudi holesterol, ki ga dobimo iz hrane prenese v prebavila, ponovno v tanko črevo. V devedesetih letih so že odkrili, da nekatere vrste bakterij v črevesju pretvarjajo holesterol v koprostanol po tristopenjski presnovni poti. Koprostanol je tukaj pomemben iz tega vidika, ker se ne absorbira v črevesju, zaradi svoje kemične strukture in se izloči iz telesa. Osebe z višjo količino tovrstnih bakterij v telesu, kažejo bistveno nižje ravni holesterola v serumu in so izpostavljeni manjšemu tveganju za bolezni srca in ožilja.

Identificirali so tri encime, ki bi katalizirali pretvorbo holesterola v koprostanol:

• ismA: Encim, za kataliziranje 1. koraka pretvorbe. Izolirali so ga iz bakterije E. coprostanoligenes.
• AKR1D1: Encim, za kataliziranje 2. koraka pretvorbe. Je dejavno vključen v sintezno pot žolčnih kislin, kjer katalizira metabolizem holesterolu podobnih molekul (7a-hidroksi-4-holesten-3-on) v koprostatonu podobne molekule (7a-hidroksi- 5b-holestan-3-on). Natančneje reducira dvojno vez na petem ogljiku sterolnega ogrodja.
• AKR1C4: Encim, za kataliziranje 3. koraka pretvorbe. Aktivno je vključen v sintezno pot žolčnih kislin, kjer katalizira metabolizem koprotatonu (7a-hidroksi-5b-holestan-3-on) podobnih molekul v koprostanolu podobne molekule (5b-holestan-3a,7a-diol). Natančneje prtvori ketonsko skupino na tretjem ogljiku sterolnega obroča v hidroksilno skupino.

Encime za 2. in 3. korak niso našli pri nobeni znani bakteriji, zato so se obrnili na naravne procese biosinteze holesterola, natančneje na sintezno pot žolčnih kislin pri ljudeh. Za tarčno bakterijo so se odločili uporabili Bacillus subtilis, ki je človeku prijazna bakterija in je za njo znano, da lahko preživi težko okolje v prebavnem traktu. Odločili so se za stabilno integracijo vseh treh encimov (ismA, AKR1D1 in AKR1C4) v genom bakterije, kjer bi se nenehno izražali brez potrebe po selektivnem pritisku antibiotikov [1].

Potek dela

Inženiring ogrodja in testi absorbacije holesterola

Da bi sintezna pot delovala v izbranem ogrodju delovalo, je moralo imeti to ogrodje sposobnost absorbirati holesterol. V literaturi je bilo objavljeno da ima Bacillus mojavensis (bližji sorodnik B. subtilis) sposobnost absorbirati holesterol in na osnovi tega so sklepali, da lahko isto naredi tudi B. subtilis. V primeru, da pa nebi bila sposobna tega pa so vanjo klonirali domnevni gen za holesterolni transporter (transporter MFS) iz Eubacterium coprostanoligenes. MFS transporter so klonirali v B. subtilis (vektor pBS1C) in jo inkubirali s holesterolom. S pretočno citometrijo so preverili, koliko holesterola so bakterije absorbirale. Problem tukaj je bila slaba topnost holesterola v rastnem mediju. Zato so pripravili mediji, ki je vseboval lectin, kateri bi emulgiral holesterol, da bi bil dostopen za bakterije. Najprej so seveda preverili, če bakterije sploh rastejo v tem mediju in nato so vzgojili kulture za ponovitev testov. Tokrat so uporabili kolorimetrične metode za določanje koncentracije holesterola ampak tudi tukaj niso dobili dobrih rezultatov, ker je holesterol po nekem času ponovno sedimentiral na dno in tudi same bakterije so nagajale kolorimetru. Ugotovili so, da je potrebo znižati koncentracijo samega dodanega holesterola. Inkubirali so wt B.subtilis, B.subtilis + MFS transporter in E.coli (negativna kontrola) skupaj s holesterolom za 24h. Ugotovili so, da MFS ne poda signifikantne razlike v absorpciji holesterola, B. subtilis pa je absorbiral holesterol sama od sebe brez potrebe po transporterju in tudi v večji meri kot E.coli. Nato so želeli potrditi, da njihova probiotska bakterija raste pri anaerobnih pogojih (kot v črevesju), kar so tudi potrdili[1].

Individualni encimski testi in vitro

Za dokaz koncepta, da zastavljena encimska pot lahko spremeni holesterol v njegove derivate so in vitro testirali vsak encim posebej. Gene iz encimske poti so klonirali v E.coli (vektor pPROEX) in določili najboljše pogoje za izražanje. Vsak gen so dali v svojo bakterijo in na vsakega pritrdili še His-tag za kasnejšo izolacijo. Uspešnost transformacije so potrdili s kolonskim PCR in ugotovili da se AKR1D1 in AKR1C4 izolirata, ismA pa ne. Predvidevali so, da je ismA ujet v vključevalno telo in sprva so ga poskusili izpustiti ven z uporabo uree, ampak to ni delovalo in zato so se odločili za gvanidin-HCl. Dosegli so izločitev ismA ampak je ta hitro agregiral. To so preprečili s dodatkom Sumo tag-a na ismA, ki bi ga stabiliziral. S tem so uspešno izolirali ismA. Uporabili so GC-MS za testiranje čistosti proteinov in uspešno so dobili kromatogram z definiranimi vrhovi. Težave so se pojavile zopet v topnosti, kjer se zelo hidrofobni steroli niso želeli raztopit. Z dodatkom Tritona X-100 so dosegli ustrezno topnost sterolov in substratov. Z encimskimi in ostalimi testi so ocenili sledeče:

• ismA: Je bil že potrjen v literaturi, da deluje. Želeli so to sami potrdit. Naslednje so naredili in vitro teste za sam ismA in za celotno reakcijsko pot. Rezultati so pokazali aktivnost ismA vendar je bila ta dokaj slaba. Celotna reakcija ni pokazala aktivnosti niti produktov. Sklepali so, da sam ismA ni produciral dovolj produkta za naslednje korake v reakciji in da bi bil pod optimiziranimi puferskimi pogoji signal verjetno višji. Nadaljevali so z in vivo testi z ismA izraženim v bakterijskem ohišju ob predvidevanju, da bo to dalo boljše in zadostne rezultate.
• AKR1D1: Na začetku je pokazal slabo katalitsko aktivnost in produkte je bilo težko detektirati.
• AKR1C4: Sprva je pokazal odlično učinkovitost katalize koprostanona v koprostanol, ki se je še povečala pri eksperimentalni optimizaciji procesa[1.

Za povečanje aktivnosti AKR1D1 so testirali veliko različnih mutiranih variant in v vse in vitro proteinske teste so vključili še 1h derivatizacijske inkubacije pri AKR1D1. Ta je direktno povezana s GC-MS detekcijo proteinskih molekul. Videli so mnogo boljše rezultate. Ob tem so optimizirali še razne druge manjše parametre. S tem so bili samozavestni pri uporabi reakcije z obema encimoma[1].

in vitro encimsi testi

Z namenom, da bi dokazali, da encima AKR1D1 in AKR1C4 skupaj delujeta, so izvedli še en skupni in vitro test. Oba encima so skupaj inkubirali, tokrat s holestenoni. Ta reakcija bi teoretično morala dati poleg koprostanona tudi koprostanol (njihov glavni produkt). Rezultati testiranja GC-MS (plinsko kromatografijo in masno spektrometrijo) so pokazali, da je bil koprastanol res proizveden -> dokaz za encimski model in teste [1].

MFS transporter

Na genomu, kjer so našli ismA so uporabili NCBI ORFfinder za identifikacijo vseh ORFjev večjih od 75bp in znotraj regije 10kpb v obeh smereh. Opazili so gen, ki se začne 91 bp downstream od ismA. 91 bp je mnogo krajše od kateregakoli znanega možnega promotorja in so sklepali, da je ta gen v istem operonu kot ismA. Ta sosednji gen so vnesli v UniProtKB in glavni zadetek je bil za neopredeljen proteinski del družine transportnih proteinov MFS (njihova funkcija je uvoz in izvoz majhnih molekul, kot so sladkorji, v in iz bakterijske celice) in ker je bil na istem operonu kot ismA so sklepali, da bi lahko to bil uvoznik holesterola. To hipotezo so preizkusili z izražanjem transporterja MFS v B.subtilis in merjenjem absorbiranega holesterola[1].

Viri

[1] CoBiota https://2022.igem.wiki/mcgill/

[2] McGill undergrads place in the top ten in worldwide synthetic biology competition. https://igem.org.mcgill.ca/

[3] World Health Organization. CardioVascular Diseases. https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/cardiovascular-diseases-(cvds)