Combined Cancer Gene Therapy

In Vitro and In Vivo Effect of 5-FC Combined Gene Therapy with TNF-α and CD Suicide Gene on Human Laryngeal Carcinoma Cell Line Hep-2

1 UVOD

Rak na grlu je ena najpogostejših oblik raka na območju glave in vratu. Manj kot 60% pacientov preživi več kot 5 let po terapiji. V študiji so preiskovali učinek kombinirane genske terapije z eksogenim tumor nekrotskim faktorjem α (TNF-α) in citozin deaminazo (CD) samomorilskim genom na celično linijo Hep-2 celic raka na grlu. TNF-α je citokin, ki lahko inhibira napredovanje rasti tumorja po različnih signalnih poteh. CD/5-fluorocitozin sistem: CD pretvori 5-FC v toksičen 5-FU, ki povzroča motnje v biosintezi DNA.

2 MATERIALI, METODE IN REZULTATI

• Kloniranje tarčnih genov in konstrukcija vektorjev: Izvedli so colony PCR z E.coli JM109 in izolirali DNA. Iz človeških levkocitov so izolirali RNA in z RT-PCR pomnožili TNF-α gen. S PCR produkti CD gena in RT-PCR produkti TNF-α gena so izvedli gelsko elektroforezo.

V pcDNA 3.1(+) vstavili TNF-α in CD gen ter tako dobili pcDNA 3.1(+)-TNF-α in pcDNA 3.1(+)-CD. Not I in Xho I sta rezala plazmid pIRES, IRES segment je bil izoliran z gelsko ekstrakcijo. pcDNA 3.1(+)-CD so razrezali, nato pa vstavili TNF-α segment in dobili pcDNA 3.1(+)-TNF-α-CD. Plazmid so ponovno razrezali, vstavili IRES in dobili še pcDNA3.1(+)-TNF-α-IRES-CD. Vektorje pcDNA 3.1(+)-CD, pcDNA 3.1(+)-TNF-α-CD in pcDNA3.1(+)-TNF-α-IRES-CD so nato rezali in produkte potrdili z gelsko elektroforezo.

• Transfekcija: Opravili so liposomsko transfekcijo po protokolu za Lipofectamin 2000 . Hep-2 celice so transfecirali s pcDNA 3.1(+)-TNF-α-CD, pcDNA 3.1(+)-CD, pcDNA 3.1(+)-TNF-α in pcDNA 3.1(+). Po transfekciji so Hep-2 inkubirali 2 tedna ob dodatku G418. Pozitivne klone so namnožili in jih poimenovali Hep-2/TIC, Hep-2/CD, Hep-2/TNF-a in Hep-2/0.

• Potrditev genske ekspresije s RT-PCR: Iz Hep-2/TIC, Hep-2/CD, Hep-2/TNF-α in Hep-2/0 so izolirali RNA. Izvedli so RT-PCR in produkte uporabili za gelsko elektroforezo.

• In vitro citocidni učinek: Hep-2/TIC, Hep-2/CD, Hep-2/TNF-α, Hep-2/0 in starševske Hep-2 celice so inokulirali v ploščo z 96 vdolbinicami (18 za vsak tip celic). Po inkubaciji so različne koncentracije 5-FC (3 vdolbinice za vsako koncentracijo). Po 96ih urah so dodali MTT in inkubirali še 4 ure. Odstranili so supernatant, dodali DMSO in z metodo ELISA izmerili absorbanco. 5-FC je imel največji učinek na Hep-2/TIC.

• "Bystander" učinek: Mešanice z različnimi vsebnostmi celičnih linij so dodali 1 mM 5-FC in po inkubaciji določili stopnjo preživetja z metodo ELISA. "Bystander" učinek so opazili v vseh petih tipih celic, najbolj v Hep-2/TIC.

• Analiza apoptoze: Hep-2/TIC, Hep-2/CD, Hep-2/TNF-α in Hep-2/0 so dodal 1 mM 5-FC in s pretočno citometrijo izmerili stopnjo apoptoze. Stopnja apoptoze se je zvišala, stopnja proliferacije pa znižala; najbolj očitno pri Hep-2/TIC.

• Detekcija TNF-α proteina: Hep-2/TIC, Hep-2/CD, Hep-2/TNF-α, Hep-2/0 so inokulirali v ploščo z 96 vdolbinicami. Po inkubaciji so zbrali supernatant in z ELISO izmerili absorbanco. Najvišjo koncentracijo so zaznali pri Hep-2/TIC in Hep-2/TNF-α.

• Subkutani tumorski model: Suspenzijo tumorskih celic so inokulirali v 53 miši, ki so jih naključno razporedili v štiri skupine: Hep-2/TIC (13 osebkov), Hep-2/CD (13 osebkov), Hep-2/TNF-α (13 osebkov) in Hep-2/0 (14 osebkov). Osmi dan po inokulaciji so pričeli z zdravljenjem s 5-FC. Merili so velikost tumorjev ter izračunali volumen in čas podvojitve. Po 30ih dneh so miši usmrtili in izolirali tumorsko tkivo. Rezultati so pokazali, da produkti izražanja CD in TNF-α genov inhibirajo rast presajenih celic pri mišjem modelu.

Primerjali so tudi patološke spremembe v izoliranem tkivu tumorjev vseh štirih skupin in ugotovili razlike med skupinami.

3 ZAKLJUČEK

Študija je z in vivo in in vitro eksperimenti potrdila sinergistično delovanje kombinacije CD in TNF-α gena. Glede na rezultate sklepajo, da je kombinacija uspela delovati na tumorje preko več različnih poti in ima aditivne učinke; TNF-α inducira visoko prepustnost tumorske vaskulature in tako pomaga zbrati in skoncentrirati 5-FU v tumorsko tkivo. Glede na rezultate so predpostavili, da bi 5-FC kombinirana genska terapija s TNF-α in CD samomorilnim genom lahko predstavljala učinkovito zdravljenje raka na grlu pri ljudeh v prihodnosti.

4 VIRI

Chai L-P, Wang Z-F, Liang W-Y, Chen L, Chen D, et al. (2013) In Vitro and In Vivo Effect of 5-FC Combined Gene Therapy with TNF-a and CD Suicide Gene on Human Laryngeal Carcinoma Cell Line Hep-2. PLoS ONE 8(4): e61136. doi:10.1371/journal.pone.0061136 http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0061136