Comparative genomic hybridization (CGH) arrays

Povzeto po: Identification of prefoldin amplification (1q23.3-q24.1) in bladder cancer using comparative genomic hybridization (CGH) arrays of urinary DNA., López V, González-Peramato P, Suela J, Serrano A, Algaba F, Cigudosa JC, Vidal A, Bellmunt J, Heredero O, Sánchez-Carbayo M.J Transl Med. 2013.

Uvod

Rak sečnega mehurja je 4. najpogostejša maligna bolezen in je predvsem pri moških na drugem mestu rakavih bolezni sečil, takoj za rakom prostate. Najpogostejši bolezenski znak je krvavitev iz sečnega mehurja, zato vsaka krvavitev zahteva takojšnji pregled. Trenutno je glavna metoda za diagnostiko raka na mehurju citoskopija v kombinaciji z urinsko citološkimi preiskavami. Izvedba citoskopije je za paciente dokaj neugodna, zato so v raziskavi želeli izvesti metodo, ki bi bila za paciente ugodnejša. Odločili so se za uporabo primerjalne genomske hibridizacije na mikromrežah (aCGH), kjer so za vzorce uporabili DNA iz urina. Za potrditev in preverjanje rezultatov, ki so jih dobili z omenjeno metodo, so uporabili še dve tehniki - fluorescenčno in situ hibridizacijo (FISH) ter imunohistologijo.

Primerjalna genomska hibridizacija na mikromrežah (aCGH)

Primerjalna genomska hibridizacija na mikromrežah (aCGH) je molekularno citogenetska metoda za preiskovanje kromosomskih neravnovesij na ravni celotnega genoma. Kvantitativne spremembe genoma vključujejo delecije (primanjkljaj oziroma izrez določenega odseka genoma), insercije (vključitev nukleotidnih zaporedij v genom), amplifikacije (pomnožitve določenega odseka DNA) in kromosomske prerazporeditve, kjer se deli dedne informacije med posameznimi kromosomi nepravilno izmenjajo. Gre za tehnično zahtevno in zamudno tehniko in kot taka je neprimerna za rutinsko diagnostično delo. Klasične citogenetske metode, s katerimi se tudi preiskuje tovrstne spremembe (kariotipizacija, proganje kromosomov, fluorescentna in situ hibridizacija – FISH, idr.) imajo pomanjkljivo ločljivost in zahtevajo celice, ki se delijo.

Na CGH mikromrežah so nanešeni klonirani poljubno dolgi (tudi do nekaj 100 kb) odseki DNA točno določene lokacije na kromosomu. To omogoča zelo natančno določevanje sprememb v genomu. Metoda se v največji meri uporablja v onkologiji, in sicer v diagnostične namene (prepoznavanje vrste raka) in s tem povezano prognozo, uporabna pa je tudi za določevanje kromosomskih aberacij različnih genetskih obolenj in za prenatalno diagnostiko različnih kromosomskih abnormalnosti, npr. Downovega sindroma. Analiza DNA različnih osebkov na mikromreži pokaže prisotnost ali odsotnost signala, kar potrjuje prisotnost oziroma odsotnost določene kromosomske spremembe, povezane z boleznijo.

Metode dela pri aCGH

Za vzorce so uporabili urinsko DNA dveh skupin ljudi. V prvi skupini je bilo 14 donorjev urina, pri katerih je bil rak na mehurju že diagnosticiran z metodo citoskopije. Druga skupina donorjev je vsebovala 8 prostovoljcev, ki niso oboleli za rakom na mehurju ter prostovoljcev, za katere ni bilo preverjeno, ali so oboleli. Po izolaciji DNA iz urina, je sledilo označevanje genomske DNA s fluorescentnimi barvili. Testno (bolnikovo) DNA so označili z zelenim barvilom (Cynanin5 oz Cy5), kontrolno DNA pa z rdečim barvilom (Cynanin3 oz Cy3). Vzorce so nanesli na mikromreže. Med hibridizacijo pride do prileganja identičnih ali podobnih zaporedij nukleinskih kislin preko nastanka stabilnih komplementarnih baznih parov. Hibridizaciji je sledila detekcija intenzitete fluorescenčo označene DNA, ki poteka pri 670nm (Cy5) in 570nm (Cy3). Z analiziranjem razmerja obeh barvil vzdolž posameznega kromosoma, sistem zazna prisotnost in/ali lokacijo kromosomskih neravnotežij po celotnem genomu, glede na vrednost CNV (copy number value), ki je določena za posamezno regijo.

Rezultati in diskusija

Rezultati, ki so jih dobili z metodo aCGH, so pokazali pogoste genomske aberacije pri rakavih bolnikih. Najbolj pogosta amplifikacija je bila detektirana na regiji 1q23.3-q24, sledijo ji tudi druge regije (1q21.2-q21.3, 1q24.2-q24.3, 5p15.3 ter 11p15.59). Določili pa so tudi regije, kjer so bile detektirane delecije DNA in sicer so to regije 10p15.3 in 11p15.5. Analiza in rezultati so pokazali, da je aCGH ustrezna tehnika za raziskovanje kromosomskih neravnovesij, ki se pojavljajo pri raku sečnega mehurja. Regija 1q23.3-q24 vsebuje več genov, največji dodatek DNA pa je sovpadal z genom za prefoldin (PFND2). To so potrdili tudi z metodo FISH. Zaradi rezultatov, ki so jih pridobili z aCGH, so s tehniko imunohistokemije raziskali tudi izražanje prefoldina ter ugotovili, da pri bolnikih, ki so oboleli za rakom sečnega mehurja, prihaja do povečanega izražanja prefoldina PFND2. Povečana količina prefoldina naj bi bila povezana s fazo tumorja in tumorsko rastjo v sečnem mehurju.

Zaključek

S pomočjo primerjalne genomske hibridizacije (CGH) so določili, da je protein prefoldin potencialni biomarker za diagnosticiranje raka sečnega mehurja, hkrati pa so PFND2 izpostavili kot možno terapevtsko tarčo, preko katere bi lahko zdravili raka. Povečana ekspresija prefoldina PFND2 je povezana z nastankom in rastjo tumorja v mehurju, vendar zaenkrat njegova vloga še ni znana.