Croc 'n Cholera - mikrobni sistem za zaznavanje in odstranjevanje Vibrio cholerae
Povzeto po projektu iGEM skupine INSA-UPS_France
Uvod
Vibrio cholerae je gramnegativna bakterija, ki povzroča kolero. Med okužbo sprošča toksin kolere, ki povzroči močno diarejo in zunajčrevesne okužbe. Najdemo jo v onesnaženi vodi, kamor se je prenesla preko fecesa okuženih osebkov, predvsem v deželah s slabimi higienskimi razmerami. Vir okužbe je lahko tudi uživanje surovih školjk in rib, ki živijo v onesnaženi vodi. Odgovorna je za več kot milijon okuženih bolnikov, od tega 120. 000 smrtnih žrtev na leto v endemičnih državah. V neendemičnih državah je smrtnost manjša, okoli 2.500 primerov letno. Osnova zdravljenja kolere je nadomeščanje izgubljene tekočine in elektrolitov z rehidratacijsko raztopino.
Skupina študentov iz Francije je v svojem projektu, s katerim je sodelovala na sinteznobiološkem tekmovanju iGEM 2017, izdelala prototip biološke naprave za zaznavanje in odstranjevanje V. cholerae iz onesnažene vode. Svoj projekt so poimenovali Croc 'n Cholera. Naprava vsebuje senzorsko bakterijo Vibrio harveyi, ki aktivira efektorsko celico – kvasovko Pichia pastoris, ob prisotnosti V. cholerae. Ta nato proizvede antimikrobni peptid iz krokodila, ki uniči vrsto Vibrio. Dodatno motivacijo za delo na projektu je skupina dobila med epidemijo kolere, ki se je razširila v Jemnu med marcem 2015 in septembrom 2017.
Sestava mikrobne šasije
Rešitve kako se spopasti z V. cholerae iščejo raziskovalci, prav tako pa so se s tem problemom spopadli že na prejšnjih iGem tekmovanjih. Delali so z bakterijo E. coli v katero so vnesli gene iz V. cholerae, preko katerih so aktivirali izražanje reporterskega gena, ki je dal izhodni signal. Projekti zaradi prevelike kompleksnosti vstavitve velike količine DNA-informacije v en sam organizem niso bili uspešni. Šasija letošnje skupine je bila sestavljena iz treh mikroorganizmov. Namesto V. cholerae so iz varnostnih razlogov uporabili E.coli, ki je proizvajala molekulski signal iz V. cholerae. Druga bakterija, ki je signal zaznala je bila genetsko spremenjena V. harveyi. Tretji mikroorganizem kvasovka P. pastoris je zaznala sporočilo in proizvedla velike količine antimikrobnega peptida, ki se je izločil s sekrecijo in liziral V. cholerae.
E. coli, ki posnema Vibrio cholerae
Mnoge bakterije med seboj komunicirajo preko zaznavanja celične gostote (quorum sensing, QS). Celice pri tem proizvajajo, sproščajo in zaznavajo signalne molekule, ki jih imenujem avtoinduktorji. Ti pa sprožijo odziv na ravni transkripcije v drugi celici. Večja gostota celic pomeni sorazmerno več signalih molekul in večji odziv. Pri V. cholerae je sinteza virulenčnih faktorjev pod kontrolo QS. Vsebuje dve poti aktivacije sestavljeni iz receptorjev LuxPQ in CqsS, ki se odzoveta na avtoinduktor AI-2 in CAI-1. Medtem ko se prvi pojavlja tudi pri drugih bakterijah, se zadnji pojavlja le pri vrsti Vibrio. Signalno molekulo CAI-1 sintetizira encim acil-CoA transferaza (CqsA). Količina izločene molekule je dober kvantitativni pokazatelj prisotnosti bakterije v vodi.
Delo s patogenimi bakterijami je nevarno, zato so uporabili spremenjeno bakterijo E. coli in tako posnemali prisotnost V. cholerae. Sev K-12 MG1655 so transformirali s plazmidom z zapisom za encim CqsA iz V. cholerae. E. coli se zlahka transformira in jo je lahko gojiti v celični kulturi. Kot senzorski organizem so si zamislili V. harveyi, zato so transformirali E. coli tudi z genom cqsA iz V. harveyi. Encim Vh_CqsA sintetizira molekulo C8-CAI-1 iz endogene molekule v E. coli: (S)-adenozilmetionin (SAM) in oktanoil-koencima. C8-CAI-1 je analog CAI-1. cqsA iz V. cholerae in V. harveyi so vstavili preko plazmida pSB1C3 pod kontrolo promotorja pLac.
Senzorski organizem Vibrio harveyi
V. harveyi je gramnegativna bakterija, katere celice se prav tako med seboj sporazumevajo z zaznavanjem celične gostote. Da bi CqsS receptor v V. harveyi zaznal molekulo CAI-1, je bilo potrebno mutirati zapis za receptor in sicer fenilalanin na mestu 175 v cistein. Avtoaktivaciji so se izognili z uporabo seva JMH626, v katerem je gen cqsA odstranjen, tako da celica ne more sama proizvajati molekule C8-CAI-1. Izbrisali so tudi gen luxS, ki zapisuje za encim pomemben v sistemu QS. Tako je spremenjen sev zaznal samo neendogene molekule C8-CAI-1.
Ko se C8-CAI-1 veže na receptor, se sproži kaskada defosforilacij, kar inhibira promotor pQRR4 in blokira transkripcijo siRNA. Translacija tarčnih genov je ob odsotnosti siRNA aktivirana. Aktivacija translacije genov pod kontrolo promotorja pQRR4 je neposredno odvisna od koncentracije vezane molekule C8-CAI-1. Pri visokih koncentracijah signalne molekule je promotor neaktiven in obratno. Ta sistem so uporabili za proizvodnjo molekule diacetila, ki aktivira P. pastoris. Diacetil nastane iz endogenega piruvata z encimom acetolactate synthase (Als). Da bi aktivirali translacijo želenega gena (als) v prisotnosti C8-CAI-1, so v sistem dodali inverter tetR/pTet, ki nizek vhodni signal pretvori v visok izhodni signal. Gen als je bil torej pod kontrolo promotorja pQRR4, diacetil se je sintetiziral kot odgovor na CAI-1 in C8-CAI-1. Zapis so v V. harveyi vstavili s plazmidom pBR1MCS-4 s konjugacijo.
Efektorski organizem: Pichia pastoris
Funkcija efektorskega organizma je proizvodnja antimikrobnega peptida (AMP), ki povzroči liziranje V. cholerae in V. harveyi. Ker je P. pastoris evkariont, je ta odporen proti peptidu, ki specifično deluje na prokarionte. Diacetil se veže na evkariontski receptor Odr-10 (z G-proteinom povezan receptor), kar vodi v aktivacijo promotorja pFUS1 preko poti Ste12, ki je prisotna tudi pri P. pastoris. Zapis za receptor Odr-10 so vstavili pod kontrolo konstitutivnega promotorja pGAP.
Antimikrobni peptid iz krokodilov je kationska molekula, ki tvori pore v bakterijski membrani. Njegov zapis so vstavili pod kontrolo promotorja pFUS1 v integracijski plazmid pPICZα. Signalni peptid α-faktor so vstavili v zapis pred AMP in je omogočal njegovo izločanje iz celice.
Rezultati
Računalniški model naprave
Med načrtovanjem modela je bilo potrebno odgovoriti na več vprašanj: Ali bo molekula CAI-1 sprožila zadosten odziv, ki bi aktiviral senzor - V. cholerae? Ali se bo proizvedlo dovolj signalne molekule – diacetila, ki bi signal prenesel na efektorsko celico P. pastoris? Ali bo efekstorska celica proizvedla dovolj antimikrobnega peptida, ki bi povzročil smrt V. cholerae? Pred začetkom laboratorijskega dela so zato naredili računalniško simulacijo celotnega sistema. Med drugi, so napovedali reakcijski čas sistema. To je čas v katerem bi dosegli nepatogene koncentracije V. cholerae in je znašal manj kot eno uro. Pri tem so uporabili veliko že znanih eksperimentalnih podatkov iz literature in sestavili kinetični model naprave. Identificirali so parametre, ki so imeli največji vpliv na sistem. Rezultati so pokazali, da se večina parametrov nanaša na proizvodnjo antimikrobnega peptida. Poleg tega pa ima vpliv tudi nivo onesnažene vode in prostornina naprave.
Molekulsko kloniranje
Pri kloniranju so uporabili mnogo biokock iz registra standardnih bioloških delov. Zapis za encim CqsA, ki je potreben za sintezo molekule CAI-1 in C8-CAI-1 so uspešno vstavili v E. coli. S pomočjo bioluminiscence so pokazali, da E. coli molekule res proizvaja. Gen als so v V. harveyi vstavili s plazmidom pBR1MCS-4. Kot zanimivost: ta bakterija je bila letos prvič uporabljena kot genska šasija na tekmovanju iGEM. Funkcionalnost receptorja Odr-10 in vivo v P. pastoris z reporterskim sistemom pFUS1-RFP. Izražanje AMP v P. pastoris so validirali z RT-qPCR in ugotovili, da nastaja v zadostnih količinah.
Prototip naprave
Skupina je zasnovala poceni in uporabniku prijazno napravo, ki vsebuje njihove spremenjene mikroorganizme. Ti so liofilizirani in se nahajajo v polimernem materialu v obliki čajne vrečke, ki omogoča difuzijo molekul (CAI-1 in AMP) obenem pa prepreči difuzijo mikroorganizmov. Za najbolj učinkovit material se je izkazal polimer ABS (akrilonitril batadien stiren). Naprava se aktivira ob prisotnosti majhne količine vode. Če je le-ta kontaminirana z V. cholerae, se iz naprave sproži AMP. Ko se ta sprosti, se lahko poveča volumen vode v kateri naprava deluje. 20-mililitrska naprava, ki vsebuje 1,4 g mikroorganizmov, učinkuje za čiščenje 1 lita vode. Izdelali so prototip 100-mililitrske naprave, ki vsebuje 7 g mikroorganizmov in zadostuje za čiščenje 5 litrov vode v eni uri.
Zaključek
Za pripravo v celoti funkcionalne in zanesljive naprave bi bilo potrebno vložiti še veliko dela. Najbolj kritični del je zagotoviti varno uporabo izdelka uporabnikom, saj le-ta vsebuje genetsko spremenjene mikroorganizme, ki ne smejo priti v vodo. Ko naprava odsluži svoj namen jo je potrebno pravilno odstraniti iz okolja. Problem pa je tudi v kontroli permeabilnosti membrane za mikroorganizme. Skupina vseeno meni, da je naprava, glede na njihove rezultate, zelo dobra naložba za detekcijo in odstranjevanje V. cholerae v onesnaženi vodi.
Viri
iGEM 2017 ekipa INSA-UPS_France
