DRIP

DRIP je projekt, s katerim se je ekipa z Univerze v Dresdnu udeležila tekmovanja iGEM 2023.

Avtorica povzetka: Klara Ažbe

Uvod

Voda je nepogrešljiva za življenje na Zemlji in predstavlja življenjski prostor za mnoge živalske in rastlinske vrste ter vir vode za kopenske vrste. Sodobna družba pa s svojim onesnaževanjem predstavlja grožnjo naravnim vodam s spuščanjem mikroplastike in mikroonesnaževal v okolje. Mikroonesanževala so raznolika skupina onesnaževal, med katerimi prevladujejo predvsem zdravila in antibiotiki z biološko aktivnostjo. V Nemčiji, od koder tudi prihaja raziskovalna skupina, je bila izvedena študija onesnaženosti voda, kjer so ugotovili, da se v površinskih vodah nahaja zaskrbljujoča količina analgetika diklofenaka in antibiotika sulfametoksazola (> 0,1 µg/L). Večino mikroonesnaževal sicer zaide v čistilne naprave, vendar pa jih kljub tristopenjskem čiščenju, čistilne naprave ne zmorejo odstraniti [1].

Ideja

Raziskovalna skupina si je zadala cilj, da bi izboljšala kakovost vode, zato so se osredotočili na najbolj prevladujoče mikroonesnaževalo analgetik diklofenak in nano-plastiko PET. Želeli so ustvariti konstrukt, ki bi ju razgrajeval in bil hkrati prijazen okolju. Za razgradnjo so izbrali encima lakazo in PETazo, ki so ju želeli imobilizirati na biosilicijev dioksid, ki se nahaja v organizmu Thalassiosira pseudonana. Thalassiosira pseudonana spada med diatomeje - enocelične alge, ki se nahajajo v sladkovodnih in morskih okoljih. Diatomeje rastejo s fotosintezo in tako predstavljajo trajnostnega gostitelja, njihova prednost pa je tudi v tem, da sintetizirajo celično steno iz SiO2, ki ima sama po sebi filtrirno sposobnost, nanjo pa se lahko in vivo imobilizirajo proteini [2]. Tako je nastal projekt Diatom-based Remediation using Immobilized Proteins, ali na kratko DRIP.

Izvedba

Za razgradnjo analgetika diklofenaka so izbrali encim lakazo (EC 1.10.3.2), ki poleg tega razgrajuje tudi antibiotik sulfometoksazol. Pridobili so jo iz dveh organizmov, B. pumillus in E.Coli. Encim PETazo (EC 3.1.1.101), ki razgrajuje polietilen terftalat (PET), pa so pridobili iz I. sakaiensis. Uporabljali so tudi njeno izboljšano različico FAST-PETazo. Da bi prišlo do vgradnje encima v celično steno diatomeje so poleg zapisa za encim morali vstaviti tudi zapis za protein, ki se nahaja v njej in izbrali so protein silafin. Za reporter pa so si izbrali eGFP, ki jim je kasneje koristil pri fluorescenčni mikroskopiji, zato so zapis zanj vstavili med gena za silfain in encim [1]. Raziskovalna skupina se je lotila dveh pristopov. Prvi, referenčni pristop so uporabili za preučevanje encimov in njihove aktivnosti. Encime so izrazili v E.Coli, ki raste hitreje kot diatomeja in so tako hitreje pridobili zadostno količino encima za eksperimente in teste aktivnosti. Drugi pristop, LiDSI (Live-Diatom Silica Immobilization) pa so uporabili za imobilizacijo encimov v celično steno diatomej [1]. Pri tem SiO2 nastaja v posebnih veziklih, v katerih silicijeva kislina polimerizira okrog organske matrice, katere del so tudi proteini (med njimi silafin). Ko se polimerizacija zaključi, se vezikli izločijo z eksocitozo in vključno z encimi postanejo del celične stene [3]. Ekipa pa se je domislila tudi zanimive dodatne uporabnosti tega konstrukta za kasneje, ko diatomeje z encimi ne potrebujemo več za čiščenje vode. Ideja temelji na sposobnosti celične stene diatomeje iz SiO2, da filtrira vodo. Tako bi lahko celice lizirali, odstranili encime in izolirali silicijev dioksid, ki bi ga uporabili kot filtrirni material v čistilni napravi. Z odstranitvijo encimov pa bi zagotovili tudi biološko varnost [1].

Metode in rezultati

Priprava konstrukta

Najprej so pripravili konstrukt za transformacijo. Pomnožili so zapise za željene proteine s PCR in jih vstavili v vektor prek cepitvenih mest za EcoRI. Uporabili so vektor pTpNR_T8, ki je že imel vstavljene zapise za silafin in eGFP, tako da so vanj vstavili samo še zapis za encim. S pripravljenim konstruktom so transformirali sev E.Coli DH5α in jih nasadili na gojišče. Pri uporabi konstruktov za vsak posamezen encim so na ploščah uspešno zrasle kolonije, iz katerih so nato izolirali DNA in izvedli test cepitve z restriktazo EcoRI. Produkte cepitve so nanesli na gel in izvedli agarozno gelsko elektroforezo. Na gelu so pričakovali dve lisi, eno za vektor z izrezanim zapisom za encim in eno za zapis za encim. Pri vseh štirih encimih so dobili pričakovane lise pri ustreznih velikostih. Za dodatno potrditev uspešnosti pa so konstrukt poslali na sekvenciranje [1].

Transformacija in izražanje encimov

Sledila je transformacija diatomej z gensko puško. Diatomeje potrebujejo kar precej časa za rast, zato so šele po šestih dneh od nacepitve v gojišče zrastle kolonije. Opazovali so jih s pomočjo konfokalnega fluorescenčnega mikroskopa in ugotovili, da je prišlo do ekspresije in imobilizacije encimov na različnih delih diatomeje glede na encim. Encim lakaza se je imobiliziral na vrhnjem delu, ki se imenuje fultoportulae, in delu, ki se imenuje ventil oz. »valve«. Encim FAST-PETazo pa so pod konfokalnim fluorescenčnim mikroskopom zaznali na krožnem pasu, imenovanem »girdle bands«. Tako so pri obeh encimih potrdili njuno in vivo imobilizacijo v celično steno diatomeje [1].

Testi aktivnosti

Ko se je imobilizacija izkazala za uspešno so želeli preveriti tudi aktivnost encimov. Najprej so testirali proste encime, ki so jih pridobili z izražanjem v E.Coli. Za preverjanje aktivnosti FAST-PETaz so izvedli test p-nitrofenil acetata (test pNPA), pri katerem FAST-PETaza pretvarja p-nitrofenil acetat v p-nitrofenol, ki maksimalno absorbira pri 405 nm. Po dodatku encima substratu so dve minuti spremljali absorbanco pri tej valovni dolžini in ugotovili, da absorbanca narašča ter s tem potrdili aktivnost prostega encima FAST-PETaze. Enak test so izvedli tudi za ugotavljanje aktivnosti FAST-PETaze, imobilizirane v celični steni. Celice je bilo najprej potrebno lizirati in izolirati celično steno, pri tem pa je skupina naletela na problem uporabe detergenta, ki lahko vpliva na aktivnost encima. Zato so izvedli ločen eksperiment vpliva detergenta na prost encim, pri katerem se je za najboljši detergent izkazal 1% IGEPAL, ki so ga nato uporabili pri izolaciji. Nato so izvedli test pNPA z imobilizirano FAST-PETazo pri sobni temperaturi, vendar pa je bil poskus neuspešen. Absorbance so sicer s časom naraščale, vendar pa je absorbanca referenčne meritve, kjer encima ni bilo, presegala vse ostale meritve. Pokus so ponovili pri 50°C, ki je optimalna temperatura za delovanje FAST-PETaze, vendar do izboljšanja rezultatov ni prišlo. Sklepali so, da je najverjetneje prišlo do avtohidrolize substrata. Na podlagi pridobljenih rezultatov niso mogli narediti zaključkov o aktivnosti imobilizirane FAST-PETaze [1].

Za testiranje aktivnosti lakaz so izvedli test ABTS, pri katerem encim lakaza substrat ABTS oksidira do kationskega radikala ABTS, ki ima maksimalno absorbanco pri 420 nm [4]. Test so izvedli tako na prostem kot na imobiliziranem encimu, in v obeh primerih je absorbanca s časom naraščala, referenčna meritev pa je stagnirala na dnu in ni naraščala. V obeh primerih je bil poskus uspešen in lahko so potrdili aktivnost proste in imobilizirane lakaze. Želeli pa so se prepričati, da je lakaza glavni encim, ki oksidira ABTS. Zato so izvedli dodatni test ABTS, pri katerem so dodali inhibitor lakaze, natrijev azid (NaN3). Vzorec z lakazo in dodatkom inhibitorja je imel občutno znižano absorbanco napram vzorcu z lakazo brez dodanega inhibitorja, kar kaže na to, da je lakaza res glavni encim, ki oksidira ABTS [1].

Testirati pa so želeli tudi delovanje diatomej z imobiliziranimi encimi ob dodatku mikroonesnaževal in ugotoviti ali pride do njihove razgradnje ali ne. Za spremljanje razgradnje mikroonesnaževal so izbrali visokoločljivostno tekočinsko kromatografijo (HPLC). Pri razgradnji PET so načrtovali spremljanje monomernih enot TPA, MHET in BHET, ki nastajajo pri razgradnji PET. Pri razgradnji diklofenaka pa so želeli spremljati para-hidroksi substituiran intermediat, ki nastaja pri razgradnji analgetika. Žal pa se jim je instrument za HPLC pokvaril in ga niso uspeli do časa popraviti, zato rezultatov niso mogli pridobiti in ne vemo, ali bi konstrukt res lahko razgrajeval mikroonesnaževala ali ne [1].

Literatura

[1] DRIP: Diatom-based Remediation using Immobilized Proteins. TU Dresden iGEM 2023 https://2023.igem.wiki/tu-dresden/ (pridobljeno 19. maj 2024).

[2] E. V. Armbrust: The life of diatoms in the world’s oceans. Nature 2009, 459, 185–192.

[3] M. Hildebrand: Diatoms, Biomineralization Processes, and Genomics. Chem Rev 2008, 108, 4855–4874.

[4] I. R. Ilyasov, V. L. Beloborodov, I. A. Selivanova, R. P. Terekhov: ABTS/PP Decolorization Assay of Antioxidant Capacity Reaction Pathways. Int J Mol Sci 2020, 21, 1131.