Diagnostika virusnih okužb

Uvod

Virusne okužbe predstavljajo velik izziv v svetu medicine, saj zaradi njih letno umre več tisoč ljudi. Zato so se čez čas razvile mnoge metode za dokazovanje virusov, ki se med seboj razlikujejo po več parametrih: natančnost, točnost, občutljivost in specifičnost. Poleg tega pa je pri posamezni metodi pomembna tudi zahtevnost njene izvedbe, cena in čas med vzetim vzorcem in dobljenimi rezultati.

Virusna izolacija

Vzorec, v katerem iščemo virus, inokuliramo v enega izmed sistemov za razmnoževanje virusov:
- celične kulture
- poskusne živali
- oplojena jajca

Najpogosteje se uporabljajo celične kulture. V teh se lahko razvijejo različni virusi, zato je pomembno, da izberemo pravilno celično kulturo glede na naš virus. Razmnoževanje virusov v celični kulturi je opazno preko morfoloških sprememb, ki jim pravimo citopatski učinki (CPU). Čeprav so spremembe značilne za nekatere vrste virusov, redko spoznamo vrsto le preko CPU, zato za dokaz vrste navadno uporabimo imunoflourescenčno barvanje. Metoda virusne izolacije potrebuje kar nekaj časa (nekaj tednov), da pokaže rezultate, prav tako pa so za interpretacijo rezultatov potrebni strokovnjaki z veliko izkušnjami. Poleg tega vse vrste virusov ne rastejo v celičnih kulturah ali pa ne pokažejo vidnih CPU.

Detekcija virusnih antigenov in antivirusnih protiteles

Virusne antigene in antivirusna protitelesa dokazujemo s podobnimi metodami, ki jih uvrščamo v skupino imuno metod. Antivirusna protitelesa pa lahko poleg tega dokažemo tudi z dvema starejšima testoma, ki nista več pogosto v uporabi: reakcija vezave komplementa in inhibicija hemaglutinacije

IMUNO METODE

Poznamo:
- radioimunsko metodo
- encimskoimunsko metodo
- imunoflourescenčno metodo
- imunsko blot metodo

Encimskoimunska metoda (EIA oz. ELISA) je najbolj razširjena metoda v svetu virusne diagnostike in je dolgo časa veljala tudi za referenčno metodo. Je visoko specifična in občutljiva metoda. Za označitev se najpogosteje uporablja alkalna fosfataza ali hrenova peroksidaza. Princip za dokazovanje virusnih antigenov ali antivirusnih protiteles je podoben. Pri dokazovanju virusnih antigenov na nosilec vežemo primarna protitelesa. Te vežejo virus v našem vzorcu in nato dodamo sekundarna, z encimom označena, protitelesa, ki se vežejo na prej nastali kompleks. Na koncu dodamo še primeren substrat, ki po delovanju encima spremeni barvo. Pri dokazovanju serumskih protiteles je sistem podoben, le da je na nosilec na začetku vezan virusni antigen, nato dodamo serumska protitelesa in na koncu z encimom označena sekundarna protitelesa, ki se vežejo na prej nastali kompleks. Iz količine razgrajenega substrata nato sklepamo o številu protiteles v serumu. Slabosti imuno metod so predvsem interference zaradi katerih pride do lažno pozitivnih oz. lažno negativnih rezultatov.

Molekularne metode

V zadnjih letih so velik vzpon na področju virusne diagnostike doživele molekularne metode. Predvsem metode, ki temeljijo na pomnoževanju delcev nukleinskih kislin, so iz laboratorijev izrinile nekatere klasične metode, kot so izolacija virusov in nekatere serološke metode ter postale celo referenčne metode in glede na njih določamo občutljivost drugih tehnik. Njihove največje prednosti so: manjše količine vzorcev, visoka specifičnost, točnost, natančnost, hitrost in avtomatizacija. Poznamo hibridizacijske metode, metode pomnoževanja nukleinskih kislin in mikromreže.

HIBRIDIZACIJSKE METODE

Pri hibridizacijskih metodah želimo dokazati del virusne DNA oz. RNA, ki je značilen za določeno vrsto virusa. To naredimo tako, da na vzorčno denaturirano DNA s ponovno renaturacijo vežemo označen, komplementaren, za virus značilen del nukleinske kisline. Temu delu pravimo lovka oz. sonda in je lahko označen z radioaktivnimi označevalci, encimi ali kemiluminescenčnimi označevalci. Če opazimo, da se je sonda vezala na vzorčno DNA, to pomeni, da je virus prisoten v vzorcu. Slabost teh tehnik je njihovo slaba občutljivost. Najbolj znane so: in situ, tekočinska in dot-blot hibridizacija.

METODE POMNOŽEVANJA DELCEV NUKLEINSKIH KISLIN

Osnovna verižna reakcija s polimerazo (PCR) poteka tako, da izolirani DNA dodamo mešanico, ki vsebuje encim polimerazo, dva začetna oligonukleotida, deoksiribonukleotidne trifosfate (dNTPs), soli (običajno MgCl2) in za polimerazo primeren pufer. Mešanico za kratek čas inkubiramo pri treh točno določenih temperaturah, kar pomeni en ciklus PCR. Pri 95°C se dvojna vijačnica denaturira v dve enojni vijačnici DNA. Pri temperaturi, ki je navadno med 50 in 65 °C, se začetna oligonukleotida pripneta na komplementarni del na DNA. Pri 72 °C se začne sinteza komplementarne verige v smeri od 5' proti 3' koncu s pomočjo polimeraze. Tako dobimo dve novi dvovijačni verigi DNA. V naslednjem ciklusu jih dobimo 4, nato 8 in tako naprej. Navadno imamo 25 do 40 ponovitev (n), število pomnoženih delov DNA pa je 2n.Po PCR reakciji se lahko rezultat običajno preverja z elektroforezo. V praksi se največ uporabljata kvantitativna različica PCR in reverzno transkriptazna PCR. Pri kvantitativni različici PCR sta pomnoževanje in detekcija narejena hkrati ( zato se v ang. Imenuje real-time PCR), kar precej skrajša celoten postopek in tudi kontaminacijo. Reverzno transkriptazno PCR pa uporabljamo za viruse z RNA, kjer pred začetkom reakcij PCR reverzna transkriptaza prepiše RNA v komplementarno DNA.

TEHNOLOGIJA MIKROMREŽ

DNA mikromreža je sestavljena iz številnih DNA oligonukleotidov, ki so pritrjeni na podlago na določenih točkah. Tem oligonukleotidom pravimo lovke oz. sonde in pri virusni diagnostiki so to značilne sekvence različnih tipov virusov. Nato inkubiramo mikromrežo z našo vzorčno DNA, ki smo jo predhodno označili, in po inkubaciji preverimo, kateri fragmenti so se hibridizirali s sondami. Če opazimo vzorec označenih fragmentov, ki so se hibridizirali z oligonukleotidi določenega virusa, lahko sklepamo, da je v vzorcu prisoten ta virus. Prednost te tehnologije je predvsem ta, da lahko preverja okuženost za več virosov hkrati.

Detekcija človeškega virusa Influence A z metodo LAMP

Virus influence je zelo pogost povzročitelj respiratornih infekcij povsod po svetu in poleg človeka okuži tudi druge sesalce (ptice, prašiči itd.). Virus vsebuje negativno enoverižno RNA z osmimi genskimi segmenti (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M in NS). Danes pojavnost novih oblik virusa influence predstavlja pomemben globalen problem saj lahko mutacija podtipa virusa privede do nove epidemije (npr.: epidemija prašičje gripe leta 2009). Gen M je iz vidika klinične mikrobiologije zanimiv, ker kodira tako za membranske kot tudi citosolne proteine (proteina M1 in M2) in je od vseh osmih segmentov najbolj ohranjen. M1 protein (citosolni) ima ključno vlogo pri nastanku novih virusnih delcev. M2 je membranski protein, ki je umeščen v virusno ovojnico in igra pomembno vlogo v interakciji z imunskim sistemom gostitelja (zunajcelična domena), poleg tega pa transmembranska domena proteina kaže aktivnost ionskega kanala.

Metoda LAMP

LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) je izotermna tehnika amplifikacije DNA. V osnovi gre za metodo, ki je zelo podobna PCR (verižni reakciji s polimerazo), s to razliko, da se celoten proces odvija pri konstantni temperaturi, z uporabo 2-3 setov začetnih oligonukleotidov in polimerazo, ki ima, poleg replikacijske aktivnosti, tudi sposobnost razmikanja verig. Izolirana virusna RNA (klinični vzorec) se najprej pretvoriti v cDNA z uporabo reverzne transkriptaze. Osnova dokazovanja prisotnosti virusa po metodi LAMP je tudi identifikacija dobro ohranjene regije virusne RNA (M gena) in načrtovanje ustreznih začetnih oligonukleotidov. Za razliko od PCR (kjer je potreben en par začetnih oligonukleotidov), potrebujemo za metodo LAMP dva para specifičnih oligonukleotidov za vezavo na šest neodvisnih vezavnih mest tarčne sekvence (F3, F2 in F1 regije na 3'-koncu ter B1, B2 in B3 regije na 5'-koncu verige tarčne DNA).

Shema vezavnih mest gena M (Fig.1 - A)
Načrtovanje začetnih oligonukleotidov

Za potek analize potrebujemo 4 tipe začetnih oligonukleotidov oz. >>primerjev<<, ki se ujemajo z 6 značilnimi regijami na izbranem (tarčnem) genu. FIP (Forward Inner Primer) je sestavljen iz F2 regije (na 3'-koncu), ki je komplementarna F2c regiji in pa zaporedja F1c. F3 primer (Forward Outer Primer) sestavlja F3 regija, ki je komplementarna F3c. BIP (Backward Inner Primer) je sestavljen iz B2 regije (na svojem 3'-koncu), ki je komplementarna B2c in pa zaporedja B1c (na svojem 5'-koncu). B3 primer (Backward Outer Primer) sestavlja B3 regija tarčne DNA, ki je komplementarna B3c regiji.

Proces ciklične amplifikacije

Shema korakov ciklične amplifikacije

Ob prisotnosti tarčne sekvence DNA in vseh potrebnih reagentov ob inkubaciji potečejo naslednji koraki:

1. Ker je pri teh pogojih tarčna sekvenca v obliki dsDNA (dvojne vijačnice) se lahko eden od začetnih oligonukleotidov spoji s komplementarno sekvenco dsDNA in povzroči iniciacijo sinteze DNA s pomočjo prisotne DNA polimeraze, ki ima poleg svoje polimerazne aktivnosti tudi sposobnost razklopa vijačnic. Pride do ločitve verig in nastanka ssDNA na katero se veže FIP.
2. DNA polimeraza nato sintetizira komplementarno verigo matrični DNA z začetkom na 3'-koncu F2 regije FIP.
3. F3 Primer se poveže z F3c komplementarno regijo in povzroči odstranitev FIP-povezane komplementarne verige.
4. Sinteza dsDNA (veriga matrične DNA + veriga sintetizirane DNA iz F3 začetnega oligonukleotida).
5. FIP-vezana komplementarna veriga se sprosti kot ssDNA zaradi delovanja DNA polimeraze in tvori zanko na 5'-koncu zaradi komplementarnih zaporedij F1 in F1c.
6. Nastala ssDNA deluje naprej kot matrica za sintezo DNA, ki jo inducira BIP (potek podoben kot v koraku 2, zanka na 5'-koncu začasno izgine). Dobimo komplementarno verigo, ki se začne na B2 regiji BIP. Za tem B3 primer izpodrine novonastalo komplementarno verigo in začne sintezo dsDNA.
7. Sinteza dsDNA (FIP-vezana veriga DNA + komplementarna sintetizirana DNA iz B3 začetnega oligonukleotida).
8. BIP-povezana komplementarna veriga DNA tvori značilno strukturo z zanko na obeh koncih (dumbbell-like structure, ker po obliki spominja na utež za treniranje) in predstavlja osnovo za cikličen proces amplifikacije metode LAMP.
9. Pride do krožnega procesa reakcij med strukturo z dvema stebelnima zankama in začetnimi nukleotidi. Rezultat je nastanek različno velikih struktur virusne DNA, ki jih gradijo alternativno izmenjujoče se ponovitve tarčnega zaporedja, ki se uredijo v nekakšno cik-cak strukturo.

Metoda LAMP tako predstavlja zelo učinkovit način pomnoževanja virusne DNA in omogoča izredno selektivno določanje prisotnosti virusnega genoma v preiskovanem vzorcu. Analiza vzorcev običajno poteka s pomočjo elektroforeze.

Viri

1. Avšič-Županc, T., Drinovec, B., Marin, J., Poljak, M. & Littera picta). Splošna medicinska virologija. (Medicinski razgledi, 2007).
2. Souf, S. Recent advances in diagnostic testing for viral infections. Biosci. Horizons 9, (2016).
3. Storch, G. A. Diagnostic Virology. Clin. Infect. Dis. 31, 739–751 (2000).
4. Cobo, F. Application of molecular diagnostic techniques for viral testing. Open Virol. J. 6, 104–14 (2012).
5. Poon, L. L. M. et al. Detection of human influenza A viruses by loop-mediated isothermal amplification. J. Clin. Microbiol. 43, 427–30 (2005).