Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola
Triklorofenoli imajo protimikrobne lastnosti in se uporabljajo za podaljšanje obstojnosti lesa, barv, usnja in zelenjave ter pri proizvodnji herbicidov, fungicidov, pesticidov, insekticidov in dezinfekcijskih sredstev. Težko jih je odstraniti iz okolja, ker niso biorazgradljivi in ker prihajajo iz različnih virov. Za ljudi so izjemno škodljivi, saj imajo karcinogene, mutagene, teratogene lastnosti, delujejo tudi kot endokrini motilci, izpostavljeni pa smo jim preko zraka, vode in hrane.
Raziskovalci so želeli s pomočjo fitoremediacije odstraniti TCP (2,4,6,-triklorofenol) iz okolja. Opazili so, da se ob izpostavljenosti TCP poveča izražanje AtPDIL1-2. Ideja: povečati izražanje AtPDIL1-2 v rastlinah, da bodo odstranjevale TCP iz okolja (zemlje). Absorbiran TCP bi ostal v ER in se tam razgradil na neškodljive spojine.
Iskanje genov, ki se povečano izražajo v prisotnosti TCP
Za remediacijo in degradacijo TCP so preiskali transkriptom navadnega repnjakovca (A. thaliana) ob odzivu na stres, povzročen s TCP. Vzgojili so sadike v prisotnosti in odsotnosti TCP. Iz rastlin so izolirali mRNA, z RT-PCR so dobili cDNA, cDNA pa so analizirali na cDNA mikromreži. Ugotovili so, da se povišano izraža 13 genov, ki zapisujejo za PDIL, najbolj pa gen, ki zapisuje za PDIL1-2 (za 2.39-krat).
Prekomerno izražanje AtPDIL1-2 v E. coli
Celotno RNA so z RT-PCR prepisali v cDNA. Fragment PDIL1-2 so pomnožili (oligonukleotidi z restikcijskima mestoma za BamHI in SacI). Po restrikciji so cDNA za PDIL1-2 vstavili v vektor pBluescript. Gen za PDIL1-2 so izrezali in vstavili v ekspresijski vektor pET-32a. S tem plazmidom so transformirali kompetentne celice E. coli DH5α[BL21]. Izražanje PDIL1-2 so inducirali z IPTG. Izmerili so aktivnost očiščenega rekombinantnega proteina – ugotavljali so, v kakšni meri ponovno zvije denaturirano RNazo A. Ob dodatku PDIL1-2 se je aktivnost RNaze A povečala. Inhibicija rasti E. coli ob prisotnosti TCP, ki je sicer toksičen za bakterije, se je zmanjšala, ko so bakterije prekomerno izražale AtPDIL1-2.
Analiza vezavnih lastnosti rekombinantnega proteina
Za določevanje vezavnosti so očiščen rekombinantni PDIL1-2 inkubirali z TCP in s HPLC določili koncentracijo preostalega TCP. Ugotovili so, da se je količina prostega TCP zelo zmanjšala. Ugotovili so tudi, da PDIL1-2 ob prisotnosti TCP ni mogel ponovno zviti RNaze A, iz česar so sklepali, da vezava TCP na PDIL1-2 okvari njegovo funkcijo. Funkcija AtPDIL1-2 se kompenzira s prekomernim izražanjem v E. coli in v tobaku.
Prekomerno izražanje rekombinantnega proteina v tobaku
Fragment ATPDIL1-2 so izrezali z BamHI in SacI in ga vstavili v rastlinski ekspresijski vektor pCAMBIA-1301 pod kontrolo promotorja 35S CaMV. Te konstrukte so z elektroporacijo vnesli v Agrobacterium tumefaciens LBA4404 in z bakterijo okužili tobak (Nicotiana tabacum cv Xanthi) z metodo listnih diskov. Poganjke so gojili na mediju s higromicinom, nato pa so jih prenesli v zemljo. Da bi ugotovili, ali je AtPDIL1-2 odporen na TCP, so spremljali rast transgenskih rastlin, ki so stabilno izražale rekombinantni protein, na plošči, v epruveti in v zemlji. Po 10 dnevih so opazili, da imajo transgenske rastline širše liste in daljše korenine v primerjavi z divjim tipom. Bile so tudi večje kot rastline divjega tipa. Po škropljenju rastlin s TCP po listih so rastline divjega tipa izkazovale klorozo, transgenske rastline pa ne. Povezali so tudi nivo izražanja AtPDIL1-2 z odpornostjo na TCP.
Fitoremediacija TCP s transgenskimi rastlinami
S pomočjo HPLC so določili preostalo količino TCP v mediju. Prav tako so analizirali in vivo akumulacijo TCP v sadikah tobaka. Količina TCP v mediju se je pri transgenskih rastlinah močno zmanjšala v primerjavi z divjim tipom. Transgenske rastline so tudi bolj uspešno razgradile TCP, ki so ga privzele iz medija.
Pomen raziskave
To je nov način bioremediacije TCP iz okolja. Prednost te metode je, da prekomerno izražanje AtPDIL1-2 ne samo odstrani prosti TCP v rastlini, ampak tudi izboljša splošni odgovor rastline na stres preko disulfid izomerazne aktivnosti.
Pojdi nazaj na MBT seminarji 2017.
