Določanje kompetence prašičjih matičnih celic za somatski jedrni prenos in kloniranje živali
Jedrni prenos je najpogosteje uporabljena metoda za kloniranje višjih organizmov. Donorsko jedro somatske celice se prenese v enukleirano jajčno celico. Nastalo celico se z električnimi impulzi stimulira k delitvi in nastanku blastociste. Ta se vstavi v nadomestno mater.
Metoda se uporablja že nekaj časa vendar so izkoristki majhni. Pri prašičih le 1-5 % prenesenih zarodkov rezultira v živo rojenem mladiču, rojeni pa kažejo tudi mnoge anomalije. Dovzetnost somatskega jedra za reprogramiranje se zmanjšuje z diferenciacijskim statusom celice (bolj kot je celica diferencirana težje bo reprogramirati jedro). Najbolj primerne celice za jedrni prenos bi torej bile matične celice. Gojenje embrionalnih matičnih celic večjih organizmov predstavlja dokaj veliko težavo, pri induciranih matičnih celicah pa pogosto ne uspejo popolnoma aktivirati endogene pluripotentnosti. Za uspešnost je pomembno tudi da uporabimo še povsem naivne pluripotentne celice, ki jih izoliramo pred implantacijo. Po implantaciji se notranja masa blastociste razdeli na epiblast in hipoblast. Iz epiblasta se še vedno lahko razvijejo vse tri zarodne plasti vendar ne tvorijo himernih celic saj so že delno specializirane glede na njihovo lokacijo.
Uporabljene celice
Da bi potrdili hipoteze so testirali pet različnih skupin prašičjih celic. Prve so izvirale iz fibroblastov pasme Large White in so izražale zeleni fluorescirajoči protein Venus. Druga skupina je predstavljala inducirane matične celice iz iste celične linije. Transkripcijske faktorje (Oct4, Sox2, c-Myc in Klf4) so v celico vnesli z virusnim konstruktom. Z deoksiciklinom induciramo izražanje transkripcijskih faktorjev, dobljeno pluripotentnost pa vzdržujemo z gojenjem v 2i pogojih. Ti naj bi se najbolje približali pogojem v notranji masi blastociste in pomenijo gojenje v prisotnosti inhibitorjev MEK in GSK3. Dodamo še levkemijo inhibitorni faktor (LIF), ker vzdržuje celice v naivnem stanju. Uporabili so še zarodne fibroblaste pasme Gottingen in inducirane matične celice pripravljene iz njih. Za pripravo so uporabili episomski vektor, ki se ne integrira v genom. Vnesli so ga z elektroporacijo. Integracija v genom povečuje možnost nastanka tumorja zaradi mutacij, ki lahko nastanejo ob vgradnji. Tekom delitev se taki vektorji v celici izgubijo. V gojišče so dodali še fibroblastni rastni faktor, ker celice vzdržuje v naivnem stanju. Peto skupino so predstavljale zarodne celice Jukatanskega prašiča, ki izražajo človeško PCSK9.
Dobljene blastociste
Po jedrnem prenosu so po uporabi fibroblastov so dobili 144 blastocist (36,7 %). Kvaliteta blastocist je bila dobra. Gottingen prašiči so izkazali veliko manjšo uspešnost- 25,2 % oz. 48 blastocist slabše kvalitete. Pri Jukatanskih prašičih je bil izkoristek 34,5 %. Inducirane matične celic so prinesle zelo majhne izkoristke, približno 10 %. Zaradi predhodnih pozitivnih izkušenj ob uporabi 10 % FCS (fetal calf serum, telečji serum) so celice gojili se v prisotnosti le tega vendar to ni signifikatno izboljšalo števila nastalih blastocist. Opazili pa so izboljšanje v izgledu.
Oploditev
Za prenos so uporabili samo zarodke iz fibroblastne linije Large White in embrionalne celice Jukatanskega prašiča. Pri prvi so oplodili dve nadomestni materi od katerih je ena postala breja in naravno skotila enega maldiča, za rojstvo treh pa so uporabili carski rez. Celotni izkoristek klonirnega procesa je 3,2 %. Na žalost noben od rojenih prašičkov ni živel več kot 6 ur. Ob pregledu trupel so ugotovili, da vsa tkiva izražajo zeleni fluorescenčni protein Venus. Pri Jukatanskih prašičih so prav tako oplodili dve samici in sicer z 200 zarodki. Obe sta postali breji in na koncu skotili 12 mladičev (4 žive). To pomeni, da je končni izkoristek kloniranja 4 %. Tudi ti večinoma niso živeli dolgo, pregled trupel pa je pokazal težave, ki so sicer značilne za to pasmo. Preživelega mladiča so evtanazirali po 2,5 letih.
Genetska analiza
Gentsko so testirali samo skupino Jukatanskih prašičev. Ob rojstvu so naredili biopsijo ušes vsem mladičem in jih genotipizirali z PCR. Preživelo samičko so parili z divjim samcem in tako dobili F1 generacijo (mladiči so bili povsem normalni). Poleg PCR so vse klonirane mladiče in generacijo F1 analizirali še z Southern prenosom. Pojavlja se različno število transgenov, ki so vgrajeni na različnih lokacijah v genomu. Ti niso vzrok za anomalije pri kloniranih mladičih saj so predhodno že klonirali prašiče z mutantno kopijo PSCK9, ki pa niso izkazovali takih anomalij kot ta celična linija.
Zaključki
Rezultati se ne skladajo s hipotezo, da se z zmožnostjo delitve povečuje tudi uspešnost jedrnega prenosa. Z induciranimi pluripotentnimi celicami so dobili najslabše rezultate in blastocist sploh niso uporabili za prenos v nadomestno mater. Možno da celice niso bile popolnoma reprogramirane ali pa gojene pod neustreznimi pogoji. Prav tako ni velikih razlik če za reprogramiranje uporabimo integracijske ali neitegracijske vektorje. Jedrni prenos je glede na rezultate možen tako z fibroblastno celično linijo kot z embrionalnimi celicami. Razen daljšega preživetja ni nobene posebne prednosti embrionalnih celic. Rojeni prašički so imeli celo večje težave pri embrionalnih celicah. V podobnih poskusih so vedno dobili dokaj slabe rezultate kar kaže, da prašičje celice najverjetneje niso tako dovzetne za kloniranje kot mišje.
