Enterobakterije, ki proizvajajo ESBL in so odporne proti karbapenemu

Enterobakterije

Enterobakterije so velika družina paličastih, po Gramu negativnih bakterij, ki so prisotne skoraj povsod – v vodi, zemlji, so del normalne mikrobne flore pri ljudeh in živalih. Veliko vrst enterobakterij se nahaja v črevesju, od koder izvira tudi ime. So fakultativni anaerobi, kar pomeni, da lahko preživijo v okoljih brez kisika, vendar pa se v okoljih s prisotnim kisikom vedejo kot aerobi. Celotno družino razdelimo na posamezne rodove glede na patologijo. Najbolj znane patogene enterobakterije so iz rodov Salmonella, Shigella in Yersinia. V določenih okoliščinah so lahko patogene tudi E. coli in bakterije iz rodu Proteus. Do leta 1980 je veljalo, da se lahko okužbe s po Gramu negativnimi bakterijami uspešno zdravi s cefalosporini, fluorokinoloni in karbapenemi, vendar pa so mnoge bakterije razvile različne mehanizme odpornosti. Ker imajo po Gramu negativne bakterije dve dodatni plasti, ki obdajata peptidoglikan, in sicer zunanjo membrano in periplazemski prostor, so že v osnovi bolj odporne na protimikrobne snovi. Tako kot pri odpornosti na druge antibiotike velja tudi za odpornost proti karbapenemom, da je lahko posledica več mehanizmov.

Bakterije lahko lastno celično steno tudi razgrajujejo. Pri tem sodelujejo avtolizini, ki so potrebni za obnavljanje in spreminjanje oblike celične stene, ter regulacijo njene rasti. Procesa izgrajevanja in razgrajevanja sta uravnotežena, ob določenih pogojih pa avtolizini sprožijo intenzivnejšo razgradnjo stene, ki vodi v celično lizo. Ta je lahko tudi posledica delovanja antibiotikov.

Karbapenemi

Karbapenemi spadajo med betalaktamske antibiotike z najširšim območjem delovanja in so odpornejši od penicilinov in cefalosporinov. Veljajo za rezervne antibiotike, saj z njimi zdravimo okužbe, pri katerih ostali antibiotiki ne učinkujejo. Leta 1960 so odkrili prvo beta laktamazo, leta 1967 pa njen prvi inhibitor olivanično kislino, ki pa je kemično nestabilna in slabo prehaja celično steno. To proizvaja po Gramu pozitivna bakterija Streptomyces clavuligerus. Naslednji odkriti karbapenem je bil tienamicin, ki ga proizvaja Streptomyces cattleya in predstavlja osnovni model za kemijsko sintezo vseh ostalih. Ker je tudi ta kemično nestabilen, so morali najti stabilnejše analoge. Leta 1985 so odkrili imipenem, ki je postal dostopen za zdravljenje okužb (Slika). Kmalu za tem so odkrili še panipenem. Njuna pomanjkljivost je bila občutljivost na dehidropeptidaze I. To so odpravili z dodatkom metilne skupine na mesto C-1 in tako dosegli odpornost na delovanje dehidropeptidaze I. Od klinično uporabnih karbapenemov se imipenem, doripenem in panipenem uporabljajo za zdravljenje okužb s po Gramu pozitivnimi bakterijami, biapenem, ertapenem in meropenem pa za zdravljenje okužb s po Gramu negativnimi bakterijami.

Zgradba in mehanizem delovanja karbapenemov

Osnovno ogrodje karbapenemov predstavlja betalaktamski obroč. Njihova zgradba je podobna penicilinu, le da imajo ti na mestu C-1 žveplov atom namesto ogljikovega (Slika). Prav mesto C-1 in metilna skupina na njem naj bi prispevali k učinkovitosti in širokemu območju delovanja karbapenemov ter odpornosti na beta laktamaze. Za odpornost proti beta laktamazam je prav tako pomembna hidroksietilna stranska veriga na mestu C-6. V splošnem se karbapenemi med seboj razlikujejo prav v sestavi stranskih skupin na mestih R-1 in R-2. Za delovanje je pomembna stereokonfiguracija R na mestu C-8, saj so takšni karbapenemi bolj aktivnih od tistih s konfiguracijo L. K odpornosti na beta laktamaze prispeva tudi konfiguracija trans na mestih C-5 in C-6.

Karbapenemi vstopijo prek proteinov zunanje membrane oziroma porinov in nato preidejo v periplazemski prostor. Njihova aktivnost je trajno aciliranje proteinov, ki vežejo penicilin (proteini PBP) - to so transglikolaze, transpeptidaze in karboksipeptidaze, ki katalizirajo tvorbo peptidoglikanov v celični steni bakterij. Natančneje, karbapenemi delujejo kot inhibitorji peptidazne domene proteinov PBP, kar onemogoča peptidno povezovanje. Ker je tvorba celične stene dinamičen proces in potekata hkrati tako sinteza kot razgradnja njenih komponent, se ob inhibiciji PBP razgradnja peptidoglikanov nadaljuje. V zadnji stopnji celica ne zdrži več osmotskega pritiska in poči.

Mehanizem odpornosti proti karbapenemom

Poznanih je pet glavnih mehanizmov pridobljene odpornosti proti antibiotikom:

• Sprememba tarčnega mesta za antibiotik
• Razgradnja antibiotika s posebnimi encimi (beta laktamaze)
• Zmanjšana prepustnost zunanje celične membrane
• Sprememba presnovne poti, na katero deluje antibiotik
• Aktivno črpanje antibiotika iz bakterijske celice

Nekateri od naštetih mehanizmov so že natančneje raziskani:

• Za prehod karbapenemov prek zunanje membrane je pomemben porin D zunanje membrane (OprD). Za vstop imipenema v celico sta pomembni zanki 2 in 3 na OprD, ki imata vezavno oziroma vstopno mesto. Zaradi različnih dejavnikov lahko pride do zmanjšanega izražanja tega porina ali njegove inaktivacije. Do neaktivnosti OprD običajno pride zaradi insercij ali delecij enega baznega para oziroma točkovnih mutacij v nukleotidnem zaporedju kromosomskega gena oprD, zaradi česar se pojavijo prezgodnji stop kodoni. Prav tako se pojavljajo insercije večjega obsega, nekatere tudi dolžine 1,3 kilobaznih parov. Vse točkovne mutacije, ki prek spremembe aminokislinskega zaporedje vplivajo na konfromacijo zank 2 in 3, najverjetneje onemogočajo vezavo imipenema (Slika). Znana mutacija je tudi skrajšanje zanke 7, zaradi česar je kanal bolj odprt in lažje dostopen za meropenem, ne pa tudi za manjše molekule imipenema. Poleg naštetega je protein OprD močno uravnavan tako na transkripcijski kot na posttranskripcijski ravni prek kovinskih ionov, nekaterih aminokislin in regulatorjev iztočnih črpalk.
• Pomembno vlogo pri odpornosti proti karbapenemom imajo tudi iztočne črpalke. Dokazali so že povezavo med prekomernim izražanjem iztočnih sistemov MexAB-OprM, MexXY-OprM in MexCD-OprJ ter odpornostjo proti posameznim karbapenemom (Slika).
• Eden od mehanizmov odpornosti so tudi mutacije in zmanjšanje transkripcije proteinov PBP, na katere posamezni karbapenemi delujejo. Pri odpornosti proti imipenemu so najpogostejše zamenjave aminokislin pri proteinu PBP2Bfr. Sevi bakterij lahko izrazijo tudi nove proteine PBP, ki jih dobijo z vnosom plazmidov, kar povezujejo z odpornostjo proti meropenemu.

Beta laktamaze

Beta laktamaze predstavljajo najpogostejši mehanizem odpornosti proti betalaktamskim antibiotikom. So periplazemski encimi, ki le-te hidrolizirajo in jim preprečijo dostop do proteinov PBP. Danes je znanih več kot 1000 beta laktamaz. V osnovi jih delimo po dveh shemah: molekularni delitvi po Amblerju in funkcionalni delitvi po Bush-Jacoby-Medeiros. Amblerjeva shema deli beta laktamaze v skupine A, B, C in D glede na aminokislinsko podobnost. V skupine A, C in D spadajo serinske beta laktamaze, v skupino B pa metalo beta laktamaze. Glede na funkcionalnost pa jih delimo na beta laktamaze razširjenega spektra (ESBL), beta laktamaze AmpC, karbapenemaze K. pneumoniae (KPC) in metalo beta laktamaze (MBL). Prvič sta jih leta 1940 izolirala Abraham in Chain in sicer iz po Gramu negativnih bakterij E. coli. Danes je znano, da jih izdelujejo po Gramu pozitivne in negativne bakterije. So rezultat genetskih transformacij in konformacijskih sprememb proteinov PBP. Odpornost bakterij omogočajo s cepitvijo amidne vezi v betalaktamskem obroču - med mestoma N-4 in C-7.

Beta laktamaze razširjenega spektra (ESBL)

Beta laktamaze razširjenega spektra (ang. extended spectrum beta-lactamase) so encimi, ki hidrolizirajo peniciline, monobaktame, cefalosporine 3. in 4. generacije in s tem onemogočijo njihovo delovanje. Izražajo tudi odpornost proti aminoglikozidom in kinolonom. Prvi ESBL sev so odkrili leta 1983 v Nemčiji. Danes je znanih preko 200 vrst teh encimov. Med klinično najpomembnejše spadajo encimi CTX-M, SHV in TEM, katerih zapisi se nahajajo na plazmidih. Tipi TEM in SHV so se razvili iz penicilinaz. Kodirata jih gena bla_tem-1 in bla_shv-1. Različne mutacije teh genov so privedle do množice različnih tipov beta laktamaz z razširjenim območjem delovanja. Gen, ki kodira CTX-M izvira iz kromosoma bakterij rodu Kluyvera. Iz kromosoma se je gen prenesel na plazmide, od tam pa v bakterije, ki so vzrok bolnišničnih okužb pri človeku. Okužba se prenaša preko onesnaženih rok, predmetov ter preko iztrebkov okužene osebe.

Karbapenemaze

Karbapenemaze spadajo v družino beta laktamaz. Prve karbapenemaze so našli pri okoljskih bakterijskih vrstah Bacillus cereus, Bacteroides fragilis in Xanthomonas malthophila. Prve so bile vrstno specifične, zapisi zanje pa so se nahajali na kromosomih. Karbapenemaze so naštete vrste začele izdelovati tekom evolucije, ker so si okolje delile z nekaterimi vrstami bakterij in gliv, ki proizvajajo betalaktamske antibiotike. Od leta 1990 so se razširile plazmidno kodirane karbapenemaze, ki se širijo med bakterijskimi vrstami. Po molekularni klasifikaciji spadajo v skupine A, B in D. Za razred A oziroma serinske karbapenemaze je značilna prisotnost serina v aktivnem mestu in disulfidna vez med Cys69 in Cys238. Ta stabilizira strukturo encima in je pomembna za hidrolizo antibiotikov, in sicer penicilinov, karbapenemov, aztreonamov, zgodnjih cefalosporinov in cefalosporinov z razširjenim spektrom delovanja. Njihovo delovanje lahko preprečita klavulanska kislina in tazobaktam. So plazmidno in kromosomsko kodirane. Razred B oziroma metalo beta laktamaze so molekularno najbolj raznolike karbapenemaze. V aktivnem mestu vsebujejo en ali dva cinkova iona, ki koordinirata dve molekuli vode potrebni za hidrolizo amidne vezi v betalaktamskem obroču. Odporne so proti penicilinom, karbapenemom, cefalosporinom in splošnim inhibitorjem beta laktamaz. Mehanizem hidrolize je odvisen od interakcije med beta laktamom in cinkovim ionom. V prisotnosti EDTA do interakcije ne pride, zato se encim ne poveže z beta laktamom in posledično ne pride do hidrolize antibiotika. So kromosomsko in plazmidno kodirane. Karbapenemaze iz razreda D oziroma oksacilinaze ali encimi OXA so sposobne hidrolizirati peniciline prvo generacijo cefalosporinov in kombinacije beta laktamov. Tako kot karbapenemaze iz razreda A imajo tudi te v aktivnem mestu serin. Večina jih je odpornih na delovanje inhibitorjev betalaktamaz. Geni za karbapenemaze OXA se nahajajo na kromosomih in plazmidih.

Viri

• Andlovic A. (2002). Enterobakterije. Medicinska bakteriologija z imunologijo in mikologijo, 179-184. Ljubljana, Medicinski razgledi
• Albiger, B., Glasner, C., Struelens, M. J., Grundmann, H., & Monnet, D. L. (2015). Carbapenemase-producing Enterobacteriaceae in Europe: assessment by national experts from 38 countries, May 2015. Eurosurveillance, 20(45), 30062. https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2015.20.45.30062
• Jeon, J., Lee, J., Lee, J., Park, K., Karim, A., Lee, C.-R., … Lee, S. (2015). Structural Basis for Carbapenem-Hydrolyzing Mechanisms of Carbapenemases Conferring Antibiotic Resistance. International Journal of Molecular Sciences, 16(5), 9654–9692. https://doi.org/10.3390/ijms16059654
• Papp-Wallace, K. M., Endimiani, A., Taracila, M. A., & Bonomo, R. A. (2011). Carbapenems: past, present, and future. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 55(11), 4943–60. https://doi.org/10.1128/AAC.00296-11