FIAT LUX

FIAT LUX je projekt v okviru tekmovanja iGEM, ki ga je leta 2022 pripravila ekipa francoskih dodiplomskih študentov z imenom INSA_LYON1. Na tekmovanju je projekt med projekti dodiplomskih študentov zasedel drugo mesto. Dostopen je na spletnem naslovu https://2022.igem.wiki/insa-lyon1/.

Problem

Enega glavnih globalnih izzivov 21. stoletja predstavlja oskrba naraščajočega števila svetovnega prebivalstva s hrano. Dodatno breme za kmetijstvo na tem področju predstavlja globalno segrevanje, ki povzroča konstantno zmanjševanje obdelovalnih površin. Posledica globalnega segrevanja je tudi pojav doslej neznanih mikroorganizmov, ki se lahko razmnožujejo v novih, toplejših pogojih in poškodujejo ter tako zmanjšajo pridelek. Za preprečevanje tega problema se trenutno uporabljajo predvsem pesticidi, ki pa imajo negativen učinek na okolje in zdravje ljudi [1].

Skupina INSA_LYON1 je želela ustvariti orodje, s katerim bi lahko na podlagi razumevanja lastnosti posameznega patogena kmetom predlagali način, ki bi širjenje patogena omejil brez uporabe pesticidov, ob tem pa se tudi njihov pridelek ne bi pretirano zmanjšal [1].

Cilj projekta

Ideja je privedla do stvaritve FIAT LUX, biotehnološkega orodja, ki v bakterijah povzroči luminiscenco in tako na neinvaziven način omogoči spremljanje njihovega namnoževanja v rastlini v realnem času. Osredotočili so se predvsem na spremljanje namnoževanja fitopatogene bakterije Dickeya solani, vendar pa je bil njihov cilj ustvariti biosenzor, prilagojen na katerokoli bakterijo. Tako bi lahko novoodkrito fitopatogeno bakterijo transformirali s tem orodjem, z njo v laboratoriju okužili ciljno rastlino in preko konstitutivne luminiscence opazovali njeno namnoževanje v rastlini. S pomočjo matematičnega modela bi lahko predvideli tudi nadaljnje namnoževanje bakterije in tako bolje razumeli ter hitreje odreagirali pri reševanju pridelka [1].

Načrt projekta

Orodje FIAT LUX temelji na ilux operonu, modificiranem lux operonu, ki emitira luminiscenco. ilux operon so si izbrali, saj v primeru izražanja v E.coli emitira 7-krat intenzivnejšo luminiscenco kot lux operon. Sestavljen je iz šestih genov (iluxC, iluxD, iluxA, iluxB, iluxE in ilux-frp), od katerih ima vsak specifično vlogo. iluxA in iluxB kodirata za luciferazni encimski kompleks, ki katalizira oksidacijo FMNH₂ do FMN in maščobnih aldehidov do maščobnih kislin, kar rezultira v luminiscenci. iluxC, iluxD in iluxE tvorijo kompleks, ki reciklira maščobne kisline nazaj do maščobnih aldehidov. ilux-frp pa je FMN reduktaza, ki reciklira FMN nazaj do FMNH₂. Emisija luminiscence z ilux operonom tako lahko poteka neodvisno, če sta le v okolju prisotna molekularni kisik in FMN, kar velja za vse aerobne celice [1, 2].

Svojo nalogo so razdelili na sledeče štiri korake:
1. Izdelava biokock.
2. Karakterizacija FIAT LUX v E.coli.
3. Dokaz koncepta v D.solani.
4. In situ opazovanje v rastlinah.

Izvedba projekta

Izdelava biokock

Ker so želeli ilux operon vstaviti v plazmidno ogrodje, so ga najprej morali prilagoditi iGEM standardom. Le-ti zahtevajo, da sta v plazmidnem ogrodju restrikcijski mesti EcoRI in XbaI pozicionirani navzgor ter restrikcijski mesti SpeI in PstI navzdol od operona. Na ilux operonu so zato odstranili pet restrikcijskih mest (3-krat PstI, 1-krat EcoRI in 1-krat XbaI) in dobili šest ilux fragmentov. Ker poskus rekonstrukcije celotnega operona naenkrat ni uspel, so se odločili, da ga sestavijo v dveh delih. Geni iluxA, iluxB in iluxE ne vsebujejo restrikcijskih mest, zato so s klasičnim PCR rekonstruirali fiatluxABE in zaporedje vstavili na ustrezno mesto v plazmidni ogrodji pSB1C3 in pBAD18. fiatluxABE je bil v pBAD18 pod kontrolo arabinoznega inducibilnega promotorja pBAD. V vektorju pACYDuet-1 so posebej konstruirali še fiatluxCD pod kontrolo šibkega konstitutivnega promotorja J23117 [1].

Preden so v plazmidu združili fiatluxABE in fiatluxCD, so preverili vpliv uvedenih mutacij na emisijo luminiscence. E.coli DH5α so transformirali z ustvarjenima vektorjema pBAD18-fiatluxABE in pACYDuet-1-fiatluxCD. Izkazalo se je, da je emisija luminiscence še vedno prisotna, torej je operon funkcionalen [1].

Želeli so, da je orodje uporabno za čim širši spekter bakterij, zato so fiatluxABE in J23117-fiatluxCD združili v konjugativnem plazmidu. Uporabili so konjugativna vektorja pSEVA521 in pSEVA531, združevanje je potekalo s HiFi združevanjem. Plazmida so nato ločeno transformirali v E.coli DH5α [1].

Karakterizacija FIAT LUX v E.coli

V naslednjem koraku so določevali optimalno koncentracijo antibiotika tetraciklina v gojišču in optimalno temperaturo, potrebno za shranjevanje transformiranih E.coli. Tako so želeli zagotoviti dolgoročno stabilnost plazmidov. Preverili so vpliv koncentracije tetraciklina in temperature za shranjevanje E.coli, transformirane s pSEVA521-fiatluxCDABE, pSEVA531-fiatluxCDABE, pSEVA521 oz. pSEVA531 (prazna vektorja). Na LB agar ploščah so pri 37 °C primerjali rast transformirane E.coli, predhodno shranjene pri –80 °C, 4 °C in sobni temperaturi, ter pri koncentracijah tetraciklina 2, 5 in 10 μg/mL [1].

Bakterija, transformirana s pSEVA521-fiatluxCDABE oz. pSEVA531-fiatluxCDABE, shranjena pri temperaturi –80 °C in 4 °C, pri koncentraciji tetraciklina 10 μg/mL ni rastla, medtem ko je pri istih pogojih bakterija, transformirana s praznima vektorjema, rastla. Pri shranjevanju na sobni temperaturi rast bakterije ni bila ovirana s koncentracijo tetraciklina. Opazili so, da bakterija, transformirana s pSEVA521-fiatluxCDABE, bolje raste pri koncentracijah tetraciklina 2 in 5 μg/mL, zato so v nadaljevanju koncentracijo tetraciklina v gojišču ohranjali med 2 in 5 μg/mL [1].

Ugotovili so, da izražanje fiatlux pri pSEVA531 zmanjšuje odpornost E.coli na tetraciklin. Vektorja pSEVA521 in pSEVA531 imata različni mesti začetka podvojevanja. pSEVA521-fiatluxCDABE nosi RK2 ORI, medtem ko pSEVA531-fiatluxCDABE nosi pBBR1 ORI, ki ima višjo stopnjo podvojevanja kot RK2. Možno je torej, da ima pri zmanjšani odpornosti E.coli, transformirane s pSEVA531-fiatluxCDABE, na tetraciklin vlogo višja poraba energije pri emisiji luminiscence, posredovani z luciferaznim encimskim kompleksom [1].

Dokaz koncepta v D.solani

Koncept delovanja orodja FIAT LUX so pokazali s prenosom plazmidov v fitopatogeno bakterijo D.solani in sicer v sev divjega tipa D.solani D s0432-1. D.solani je bakterija, odgovorna za bolezni številnih kmetijskih in okrasnih rastlin po vsem svetu. Bakterija proizvaja različne encime (pektinaze, celulaze in proteaze), ki razgrajujejo celično steno rastlinskih celic. Iz mrtvih rastlinskih celic nato bakterija pridobiva hranila ter se namnožuje po rastlinskem tkivu. Njena večja agresivnost v zadnjem obdobju je najverjetneje povezana s temperaturnimi spremembami zaradi globalnega segrevanja ozračja [1, 3].

Prenos v bakterijo so pokazali za plazmide pSEVA521-fiatlux, pSEVA531-fiatlux, pSEVA521 in pSEVA531. Prazna vektorja sta služila kot kontrola. Prenos so izvedli z metodo konjugacije. Najprej so s transformacijo vstavili plazmid v sev E.coli MFDpir. Po 48-urni inkubaciji pri 37 °C v prisotnosti 5 μg/mL tetraciklina so s kamero z visoko občutljivostjo zaznali luminiscenco. Po uspešni transformaciji je sledila konjugacija med E.coli MFDpir in D.solani. Po 48-urni inkubaciji pri 30 °C v prisotnosti 5 μg/mL tetraciklina so s kamero z visoko občutljivostjo zaznali luminiscenco. Potrdili so, da so vsi štirje plazmidi uspešno vstavljeni v D.solani, emisijo luminiscence pa so zaznali le v kolonijah, ki so vsebovale pSEVA521-fiatlux oz. pSEVA531-fiatlux. S pektinaznim testom so potrdili, da so kolonije, zaznane po konjugaciji, res D.solani [1].

Karakterizacija fiatlux v D.solani je potekala podobno kot predhodno v E.coli. Kot pri E.coli, so tudi pri D.solani opazili, da bakterija s pSEVA531-fiatlux emitira prej in več luminiscence kot bakterija s pSEVA521-fiatlux. Stabilnost plazmida v D.solani so preverili tako, da so z merjenjem OD pri 600 nm šteli bakterijske celice, ki so zrasle na gojišču LB in gojišču s 5 μg/mL tetraciklinom. Eksperiment so nastavili tako, da je poteklo devet celičnih celitev D.solani na dan, izvajali pa so ga tri dni. Po 27 generacijah (celičnih delitvah) je bakterija ohranila plazmid, kar zadostuje, če upoštevamo, da bakterija in situ niti ne doseže toliko generacij [1].

In situ opazovanje v rastlinah

Na koncu so preverili, če njihovo orodje deluje in situ v rastlinah. Poskus so izvedli na listih cikorije in na gomoljih krompirja [1].

Za infekcijo listov cikorije so uporabili D.solani, transformirano s pSEVA521-fiatlux, pSEVA531-fiatlux, pSEVA521 oz. pSEVA531. Po 30 in 48 urah so izmerili okuženo površino in opazovali luminiscenco listov. Največ znakov infekcije je kazala D.solani s pSEVA531 in pSEVA531-fiatlux. Poleg tega so zaznali tudi večjo emisijo luminiscence pri infekciji z D.solani s pSEVA531-fiatlux kot pri pSEVA521-fiatlux. Na ta način so potrdili, da je plazmid pSEVA531-fiatlux bolj učinkovit od pSEVA521-fiatlux [1].

Poskus infekcije so izvedli tudi na gomoljih krompirja, vendar so tokrat za infekcijo uporabili le D.solani, transformirano s pSEVA531-fiatlux oz. pSEVA531. Po 24 in 48 urah so gomolje prerezali in ocenili nagnito površino. Infekcija je bila tudi tokrat učinkovita [1].

Uporaba orodja

Rezultati so pokazali, da je orodje FIAT LUX uporabno na primeru bakterije D.solani. Uspešno so transformirali tudi dva druga seva, Citrobacter rodentium in Pseudomonas putida, ki sta prav tako po konjugaciji emitirala luminiscenco. Z dokazom koncepta delovanja bi se orodje torej lahko izkazalo za zelo učinkovito. Po prejemu vzorca okužene rastline bi raziskovalci identificirali fitopatogen in nato spremljali njegovo namnoževanje pod različnimi pogoji z orodjem FIAT LUX. V doglednem času bi lahko predlagali način, ki bi preprečil širjenje patogena ter ga uničil [1].

Viri

[1] FIAT LUX https://2022.igem.wiki/insa-lyon1/index.html.
[2] C. Gregor, K. C. Gwosch, S. J. Sahl, S. W. Hell: Strongly Enhanced Bacterial Bioluminescence with the Ilux Operon for Single-Cell Imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2018, 115, 962–967.
[3] M. A. Matilla, R. E. Monson, G. P. C. Salmond: Dickeya Solani. Trends Microbiol. 2023, xx, 1–2.