Fermentativna proizvodnja N-metilantranilata z inženirsko spremenjeno Corynebacterium glutamicum

N-metilantranilat (NMA) je N-funkcionalizirana aminokislina, ki je pri rastlinah intermediat biosinteze akridonskih alkaloidov. Nastane z od S-adenozil metionina (SAM) odvisno metilacijo in inducira sintezo N-metiliranih akridonskih alkaloidov in avenacina v rastlinah. Industrijsko se uporablja kot prekurzor bioaktivnih komponent, kot so protirakave učinkovine akridonski alkaloidi, ki delujejo kot inhibitorji topoizomeraze, protibolečinski alkaloid O-izopropil-NMA, aromatična spojina O-metil-NMA ali kot gradniki peptidnih zdravil [1].

N-funkcionalizacija aminokislin

Proces N-funkcionalizacije najdemo v vseh domenah življenja, produkti le te pa so vključeni v številne biološke vloge. Tehnološko je dobro poznana kemična sinteza N-alkiliranih aminokislin, ki pa ima nizke izkoristke, uporablja toksične reagente, pride pa tudi do prekomerne metilacije in nezadostne čistosti nastalih enantiomerov. Encimski postopek z N-metiltransferazami na drugi strani pa je močno odvisen od sistema za regeneracijo kofaktorjev. V predstavljenem delu so avtorji pripravili sistem za proizvodnjo NMA preko metabolnega inženirstva bakterije Corynebacterium glutamicum transformirane z genom za antranilat N-metiltransferazo (ANMT) iz vinske rutice [1].

Izbor sevov za eksperimentalno delo

V raziskavi so uporabljali C. glutamicum, ki je zelo pogosto uporabljena bakterija za industrijsko proizvodnjo aminokislin. Gre za G+ talno bakterijo, ki raste na preprostih gojiščih z dodanimi mineralnimi snovmi, kot vir ogljika pa lahko uporabi različne sladkorje, citrat in alkohole. Specifični sev, ki so ga uporabili, je C. glutamicum C1* z za 13,4 % zmanjšanim genomom in robustno odpornostjo na okoljske strese [1, 2, 3]. Plazmide so konstruirali v celicah E. coli DH5α in E.coli S17. Pripravili so dva tipa plazmidov in sicer pGold, kot prenosljivi ekspresijski vektor s prepoznavnim mestom za BsaI, in pK19mobsacB, ki je bil uporabljen za konstrukcijo insercij in delecij v C. glutamicum C1* [1, 4].

Potek eksperimentalnega dela

C. glutamicum je pogosto uporabljena za fermentacijsko proizvodnjo aminokislin, ampak še ni bila spremenjena za proizvodnjo NMA, zato so morali sprva preveriti, če bakterija sploh lahko raste pri visokih koncentracijah antranilata in NMA. Preverjali so rast pri različnih koncentracijah in ugotovili, da sev ni pretvarjal dodanih snovi, koncentracije pa so ostajale podobne tekom kultivacije. Zaključili so, da je sev primeren za produkcijo NMA [1].

Antranilat je intermediat šikimatne sintezne poti, zato so sev C. glutamicum C1* optimizirali za nastajanje intermediatov, odstranili ozka grla in zmanjšali nastajanje stranskih produktov. Izvedli so homologne rekombinacije z uporabo vektorja pK19mobsacB. Homologne predele so pridobili iz wt C. glutamicum in jih preko Gibsonovega sestavljanja vstavili v razrezani vektor. Prenos pripravljenega vektorja v bakterije so izvedli s transkonjugacijo iz E. coli S17. Selekcija je potekala preko kanamicinske rezistence in preko neobčutljivosti na sukrozo [1, 4].

Najprej so v genom vstavili gen aroG in nadalje deletirali ldhA gen za laktat dehidrogenazo-A. Deletirali so regulatorni sugR gen ter s tem povečali ekspresijo genov glikolize in privzem sladkorjev in dodali še gen aroR za translacijski regulatorni vodilni peptid gena aroF – tako so se znebili negativne translacijske kontrole izražanja. Operon qsuABCD so nadomestili s qsuC z močnim konstitutivnim Ptuf promotorjem. Gen za fosfoenolpiruvat karboksilazo ppc so zamenjali z dodatno kopijo endogenega aroB, kar je povečalo dovajanje fosfoenol piruvata v šikimatno pot. Da bi povečali sintezo drugega prekurzorja šikimatne poti eritroze-4-fosfata, so nativni promotor gena za transketolazo tkt nadomestili s Ptuf promotorjem. Zamenjali so še gen iolR, v odsotnosti katerega je dereguliran operon za katabolizen inozitola, in pck gen za fosfoenolpiruvat karbokinazo. Nazadnje so v genom še vrnili gen za sugR transkripcijski regulator. Tako so z metabolnim inženirstvom dobili sev, ki proizvaja več antranilata [1].

NMA se sintetizira iz antranilata v enostopenjski reakciji z ANMT. Gen za ANMT so vstavili preko vektorja pGold, ki so ga pripravili s spremembo pEC-XK99E, da je postal uporaben za Golden Gate modularno sestavljanje. Naravno zaporedje gena ANMT so kodonsko optimizirali in sestavili s kompatibilnimi previsnimi konci. Dodali so še sahH gen za S-adenozil homocisteinazo in ga z elektroporacijo vnesli v celice [1].

Priložnosti za prihodnost

S tem delom so pripravili sistem za učinkovito proizvodnjo NMA z rastlinskim genom za encim ANMT v C. glutamicum, kar lahko predstavlja pomemben nov način priprave NMA in drugih industrijsko in medicinsko pomembnih snovi, ki jih dobimo iz tega prekurzorja. V metabolizmu C. glutamicum so še vedno prisotna nekatera ozka grla, kot sta nepopolna konverzija šikimata v antranilat, in nepopolna N-metilacija antranilata z od-SAM-odvisno ANMT. To raziskovalno delo je odlična točka za nadaljnje spremembe, ki bi naslovile še obstoječe težave in optimizirale proizvodnjo NMA, ki sedaj dosega 0,34 g/L [1].

Literatura

[1] Walter T, Al Medani N, Burgardt A, et al. Fermentative N-Methylanthranilate Production by Engineered Corynebacterium glutamicum. Microorganisms. 2020;8(6):866.

[2] Gopinath V, Nampoothiri KM. Corynebacterium glutamicum. Encyclopedia of Food Microbiology: Second Edition. Elsevier Inc.; 2014:504–517.

[3] Baumgart M, Unthan S, Kloß R, et al. Corynebacterium glutamicum Chassis C1∗: Building and Testing a Novel Platform Host for Synthetic Biology and Industrial Biotechnology. ACS Synth Biol. 2018;7(1):132–144.

[4] Schäfer A, Tauch A, Jäger W, Kalinowski J, Thierbach G, Pühler A. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum. Gene. 1994;145(1):69–73.