Gene silencing shRNA

OD RNA POSREDOVANO UTIŠANJE GENOV N-NIKOTINAMID METILTRANSFERAZE, POVEZANO Z ZMANJŠANO TUMORGENOSTJO V CELICAH HUMANEGA ORALNEGA KARCINOMA

Oralni skvamozni celični karcino(OSCC) je pogosta in dokaj smrtna oblika tumorja. Smrtnost je visoka zaradi njegove zapoznele diagnoze. Encim N-nikotinamid metiltransferaza katalizira N-metilacijo nikotinamida, pirimidinov in drugih strukturnih analogov,ki imajo pomembno vlogo pri biotransformaciji in detoksikaciji ksenobiotikov. N-metilacija je tudi metabolna pot izločanja nikotinamida. Nikotinamid je normalno prisoten v celicah in je močan inhibitor encimov, kot so histonske deacetilaze, povezane z odgovorom na stres, regulacijo apoptoze in poli (-adenozin difosfat riboze) polimeraze (PARP), ki je pomembna pri DNA odzivu na poškodbe. NNMT pa zniža nikotinamidni intracelularni nivo in tako vpliva na celično rast in kemorezistenco. Njegovo povečano ekspresijo so ugotovili pri široki različici tumorjev, ter so tako hoteli raziskovati njegov prispevek h karcinogenosti OSCC. Ekspresijo NNMT so v študiji preučevali na sedmih humanih rakavih celičnih linijah(PE/CA-PJ15, PE/CA-PJ34, PE/CA-PJ41, PE/CA-PJ46, PE/CA-PJ49, HSC-2, HSC-3) z RealTime PCR, Western Blot analizo in testom katalitične aktivnosti. Posledično so ocenili tudi efekt z shRNA povezanega utišanja gena NNMT na celično proliferacijo. NNMT so detektirali v vseh testiranih celičnih linijah, največji ekpresijski level pa so zaznali v PE/CA-PJ15 celicah.

shRNA

Shor hairpin(sh) RNA je dvoverižna RNA, ki tvori zanko in se lahko uporabi za utišanje genske ekpresije preko RNA interference. Ekspresijo v celicah dosežemo z dostavo plazmidov, lahko pa tudi preko bakterijskih celic. Ko se vektor integrira v gostiteljski genom poteče shRNA transkripcija v jedru. Pre-shRNA se eksportira iz jedra v citoplazmo. Protein Dicer procesira shRNA, odstrani se zanka in nastane siRNA.Nato se poveže v RNA induciran utiševalni kompleks (RICS). Sense veriga se razgradi, antisense veriga pa usmeri RICS do mRNA, ki ima komlementarno sekvenco. RICS represira translacijo mRNA. ShRNA pripelje do utišanja genov.

Metode

Količino kvantitativne NNMT mRNA so določili z RealTime PCR. Naredili so tudi Western Blot analizo pri kateri so hoteli oceniti NNMT proteinski ekspresijski nivo in tudi NNMT encimski test, ki temelji na metodi HPLC s katerim so analizirali NNMT aktivnost (test temelji na merjenju količine nastalega N-metilnikotinamida). S testi so zaznali NNMT v vseh testiranih celičnih linijah, največjo ekspresijo pa so zaznali pri PE/CA-PJ15 celicah.

ShRNA plazmidna transfekcija

Uporabili so set vektorjev pLKO.1, ki so vsebovali kasete z lasnično zanko(hairpin loop), ki kodirajo shRNA s tarčo na humani NNMT. Celice PE/CA-PJ15 so transfecirali s štirimi shRNA plazmidi(pLKO.1-330, 1-448, 1-164, 1-711) proti NNMT. Kontrolne celice so tretirali le s transfekcijskim agentom (mock ). 48 ur po transfekciji so celice nacepili na medij s puromicinom, saj je plazmidu vseboval rezistenco proti puromicinu. Učinkovitost genskega utišanja so zaznali z Real Time PCR in Western Blot analizo. Ugotovili so, da je bila ekspresija NNMT zmanjšana v transfeciranih celicah. V primerjavi s kontrolnimi celicami(mock) je bila ekspresija 6,25 krat nižja.

Izvedli so še kolorimetrični MMT test, s katerim so ocenili celično proliferacijo. Test s 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenil tetrazolin bromidom (MTT), meri spremembo MMT v netopni formazan. Število nastalih kristalov korelira z številom vaiabilnih celic. Reakcijski produkt so pomerili še z absorbanco pri 595. Inhibicijo celične proliferacije so potrdili s testom na mehkem agarju rastočih kolonij, kjer je bilo opazno, da so bile kolonije z NNMT, pri katerih so plazmidi utišali gen za proliferacijo manj številne v primerjavi s kontrolnim celicami. S testom tumorgenosti so ocenli efekt razkapanja (knockdown)NNMT. Subkutano so vnesli transfekcijske in kontrolne PE/CA-PJ15 celice v miške na levo in desno stran hrbta.Uporabili so miške brez timusa. Velikost tumorjev so tedensko merili in računali volumen tumorja po formuli :dolžina x širina x višina. Ugotovili so da je bila rast tumorjev zmanjšana v miškah s transfekcijskimi celicami, v primerjavi s tistimi,v katere s vnesli kontrolne celice.

Zaključek

Ugotovili so, da zmanjšano izražanje NNMT vodi do inhibicije proliferacije in tudi do zmanjšane rakaste aktivnosti pri OSCC. Pri miškah so opazili, da ko je prišlo do utišanja genov, je tudi prišlo do redukcije tumorskega volumna. Z RNA interference knockdow DNA predstavlja novo orodje za študij biološke vloge NNMT in njegove uporabe pri terapevtskem zdravljenju ter zgodnjemu prepoznavanju OSCC. Slabost metode shRNA plazmidne transfekcije je v tem, da se ne more uporabiti in vivo in ima dokaj omejeno uporabo