Genetsko vezje na osnovi rekombinaze za spremljanje težkih kovin
Izhodiščni članek: D. Akboğa, B. Saltepe, E. U. Bozkurt, U. Ö. Ş. Şeker: A Recombinase-Based Genetic Circuit for Heavy Metal Monitoring. Biosensors. 2022, 12, 1-10.
Uvod
Spremljanje toksičnosti težkih kovin v okolju postaja nujna skrb, ker se industrija vse bolj razvija. Težke kovine tvorijo kovalentne vezi z organskimi molekulami, pri čemer vplivajo na celične organele in ireverzibilno poškodujejo DNA, ter zavirajo celični cikel. To vodi v apoptozo in karcinogenezo. Trenutno so metode določanja toksičnosti težkih kovin sekvenčna sedimentacija, masna spektrometrija z induktivno sklopljeno plazmo (ICP-MS), atomska absorpcijska spektrometrija. Te analitične metode zahtevajo drage instrumente in usposobljeno osebje. Izziv pri pravilni oceni toksičnosti predstavlja odkrivanje frakcij težkih kovin, ki so biološko razpoložljive, saj lahko spremljanje biološke uporabnosti dodatno pomaga pri merjenju kvantitativnih učinkov teh kovin na okolje. Z izzivom odkrivanja biološko uporabnih frakcij se spopadajo biosenzorji na osnovi celice s pomočjo intrinzičnih regulatornih mehanizmov [1].
Hiter razvoj pri načrtovanju genetskega vezja je omogočil, da so biosenzorji na osnovi celic postali pomembni pri odkrivanju širokega spektra analitov in postajajo obetavni na številnih področjih, od medicinske diagnostike do ocene onesnaženosti okolja. Sintezna biologija je napredovala v konceptu biosenzorja, ki temelji na pristopu z moduli bioloških delov, ki so povezani in dobijo odziv logičnih vrat. Glavni mehanizem biosenzorja na osnovi celice je odkrivanje določene vrste analita in ojačanje te identifikacije v električni in optični signal prek procesorja. Sestavljen je iz treh modulov, modula ki zazna vhodni signal, reporterskega modula, ki pretvarja vhodni signal v izhodni signal znotraj celice šasije, ter izhodnega modula. Prednosti uporabe biosenzorjev na osnovi celice je njihovo enostavno gojenje, zaznava širokega spektra snovi in da ne zahtevajo posebnih tehnik za analizo [1,2,3].
Modularnost bioloških delov olajša konstrukcijo pol specifičnih biosenzorjev (izkoriščajo odziv mikroba na stres) in specifičnih biosenzorjev (specifična ciljna molekula aktivira ali zavira transkripcijo določenega izhoda). Poleg tega so rekombinaze eno od orodij sintezne biologije, ki se pogosto uporablja v logičnih vratih. Z obračanjem/izrezovanjem ciljnega zaporedja, ki ga obdajajo mesta prepoznavanja, rekombinaze zagotavljajo mehanizem ON/OFF. Odziv ON/OFF lahko zniža signal ozadja biosenzorja, ki temelji na vezju, ko je aktivacija promotorja odvisna od aktivnosti rekombinaze [1].
V študiji so predlagali biosenzorni sistem za težke kovine na osnovi rekombinaze. Združili so pol specifično biosenzorno napravo, predhodno izdelan mehanizem odziva na toplotni šok s specifičnim biosenzornim modulom. Optimizirali so pogoje kadmijevega biosenzorja na osnovi rekombinaze, da bi dosegli povečano spremembo in krajši odzivni čas. Ta sistem je mogoče razširiti za različne težke kovine, da bi naredili vrsto biosenzorjev na osnovi celic, tudi z uporabo na pol specifičnih delov sistema zaznavanja [1].
Konstrukcija senzorja na osnovi rekombinaze za detekcijo kadmija
V biosenzorju na osnovi celice so uporabili pol specifični biosenzorski sistem toplotnega šoka. Konstitutivno izražen transkripcijski represor proteina toplotnega šoka (HspR) negativno uravnava promotor, PdnaK. Promotor vsebuje dvojne motive vezave HspR (IR3). Uvedba stresnega faktorja vpliva na vezavo proteina HspR na regulativne domene promotorja PdnaK. Obstajajo različni faktorji stresa, kot so toplota, oksidativni stres in težke kovine [1].
Za povečanje specifičnosti takšnih biosenzorjev so uporabili biosenzor, ki ga sestavljajo geni za odpornost proti ionom težkih kovin. Za konstruiranje senzorja za zaznavanje kadmija, so vključili predhodno izdelan sistem odgovora na toplotni šok, ki nadzoruje izražanje za kadmij specifičnega transkripcijskega faktorja, CadR, in mestno specifične rekombinaze Bxb1. Brez faktorja stresa je kognitivni promotor CadR, PcadA, inaktiviran, saj je njegovo zaporedje obrnjeno v začetnem vezju. Obkrožajo ga mesta za prepoznavanje Bxb1. V prisotnosti kadmijevih ionov se HspR sprosti iz PdnaK, kar omogoča izražanje Bxb1 in CadR. Medtem ko Bxb1 rekombinira obrnjeni promotor PcadA, CadR tvori heterodimerne komplekse s kadmijevimi ioni in se veže na PcadA, kar sproži izražanje fluorescenčnega reporterja GFP [1].
Rezultati
Karakterizacija sistema za optimalne delovne pogoje
Na začetku so optimizirali vezje s pogoji za aktivnost rekombinaze iz literature. Eden od ciljev študije je opredeliti vgradnjo rekombinaze in pridobiti optimalne pogoje kadmijevega biosenzorja na osnovi rekombinaze, tako da ima sistem strog nadzor nad puščanjem in skrajšan odzivni čas glede na zahtevo po dolgem času zaradi pravilne ekspresije in aktivnosti rekombinaze Bxb1. Dodatno so želeli izboljšati odmerek-odziv biosenzorja, zato so želeli doseči nizko bazalno ekspresijo v stanju OFF. Občutljivost odzivnosti je v skladu z naraščajočimi koncentracijami kadmijevih ionov [1].
Optimizacijo sistema so začeli z gojišči. Najprej so uporabili gojišče LB, vendar je njegova nedefinirana narava povzročila nizek izhodni signal, za kar se je tudi predhodno izkazalo, da zmanjša občutljivost na kovine v takih biosenzorjih. Nato so prešli na minimalno gojišče težkih kovin MOPS, vendar je to tudi zagotovilo slab potencial rasti za biosenzorje na osnovi celic na osnovi rekombinaze, inducirane z visoko toksičnimi kadmijevimi ioni. Boljše rezultate so opazili z uporabo MOPS minimalnega medija. Intenzivnost fluorescence se je povečala glede na naraščajoče koncentracije kadmija [1].
Ob uporabi minimalnega medija MOPS za biosenzor na osnovi celice so nato testirali optimalno začetno število celic pred indukcijo, s spremembo faktorja redčenja za čez nočne celične kulture. Domnevali so, da lahko sprememba začetnega števila celic izpostavljenih kadmijevim ionom, vpliva na občutljivost mehanizma celičnega stresa. Primerjali so učinke začetnih števil celic na odziv senzorja z uporabo razredčitev čez nočnih kultur 1:250, 1:100 in 1:50. Izhodni signal je bil je bil od koncentracije začetnega števila celic značilno različen. Celice razredčene na 1:50 in inducirane v logaritemski fazi (OD600 ~ 0,5), so izboljšale obnašanje glede na odmerek in zmanjšale odzivni čas za kasnejše korake optimizacije na 14 ur [1].
Sprva so reakcijo izvedli pri 30 °C, saj je optimalna za in vitro reakcije integraze z uporabo linearnih DNA substratov. Domnevali so, da lahko biosenzor na osnovi celice, ki temelji na rekombinazi zahteva drugačno temperaturo. Senzor so inkubirali pri 23 °C, 30 °C in 37 °C, da bi primerjali njihove učinke. Več t-testov, ki primerjajo koncentracije 0–50 µM kadmijevih ionov za tri različne temperature, je pokazalo, da ima biosenzor, gojen pri 37 °C, večji statistični pomen v prisotnosti induktorja. Poleg tega so optimizirali pH gojišča. Začetno temperaturo so ohranili pri 30 °C, da bi optimizirali delovanje biosenzorja. Najbolje je deloval pri pH 7,5, ki ustreza pH MOPS minimalnemu mediju. Rezultati so pokazali, da bi lahko izdelani biosenzor za kadmij najbolje deloval v minimalnem mediju MOPS (pH 7,5) pri 37 °C [1].
Po optimizaciji so postavili eksperiment, da preizkusijo biosenzor v optimalnih delovnih pogojih, opisanih prej. Rezultati so pokazali, da se je biosenzor na povečanje koncentracije kadmija v optimalnih delovnih pogojih odzval v 10 urah. Sistem se ni odzval na koncentracije kadmija, nižje od 50 µM. Nižjih koncentracij ionov ni bilo mogoče razlikovati od ozadja. Najvišja koncentracija kadmija, ki je povečala izhodni signal, je bila tudi pri 50 µM [1].
Nato so se odločili, da testirajo aktivnost biosenzorja, ki temelji na rekombinazi, proti drugim izbranim nabitim kationom težkih kovin (II) (arzen in svinec), saj so prejšnje raziskave razkrile navzkrižno reaktivno naravo transkripcijskih faktorjev družine MerR, v katero spada tudi CadR. Ugotovili so, da ima senzor signal v ozadju za arzenove in svinčeve ione, ampak niso opazili, da bi ustvarili pomemben signal pri 50 µM koncentracije kadmija, kar je optimalna odzivna točka za sistem. Testiranje z ioni težkih kovin je razkrilo bazalni signal za ta sistem [1].
Ta sistem je mogoče testirati z drugimi bakterijami za izboljšanje odzivne krivulje in doslednosti izhoda ter nižjega ozadja, saj je bilo ugotovljeno, da se meje zaznavanja lahko razlikujejo med bakterijskimi vrstami. Poleg tega, ker so mikroorganizmi razvili podobne mehanizme odpornosti na podobno skupino ionov ali molekul, bi morali razširiti analizo navzkrižne reaktivnosti in vključiti dele s samo specifičnimi reakcijami na njihove analite, ki nastanejo z usmerjeno evolucijo. Nazadnje bi lahko povratno vezje ali genetski ojačevalnik razširilo biosenzor na osnovi celice, ki temelji na rekombinazi, da bi izboljšali meje zaznavanja [1].
Zaključek
Z ugotovitvami poročajo o senzorju kadmija na osnovi rekombinaze, ki uporablja kombinirano zasnovo za pol specifične in specifične, vendar navzkrižno reaktivne transkripcijske enote. Sistem je optimiziran za doseganje največjega signala opaženega pri 50 µM, vendar nižjih koncentracij ionov ni bilo mogoče razlikovati od ozadja. Sistem pa je obetaven za uporabo rekombinaze v biosenzorju na osnovi celice za integracijo več transkripcijskih enot za pridobitev odziva organizma, ki temelji na težkih kovinah. Poglobljena prihodnja študija za izboljšanje značilnosti v smislu selektivnosti in občutljivosti bi lahko zagotovila biosenzor, ki je pripravljen za uporabo odkrivanja različnih težkih kovin [1].
Viri
[1] D. Akboğa, B. Saltepe, E. U. Bozkurt, U. Ö. Ş. Şeker: A Recombinase-Based Genetic Circuit for Heavy Metal Monitoring. Biosensors. 2022, 12, 1-10.
[2] Q. Gui, T. Lawson, S. Shan, L. Yan, Y. Liu: The Application of Whole Cell-Based Biosensors for Use in Environmental Analysis and in Medical Diagnostics. Sensors. 2017, 17, 1-17.
[3] K. J.Hyun, J. Haeyoung, J. L. Sang: Synthetic biology for microbial heavy metal biosensors. Anal. Bioanal. Chem. 2018, 410, 1191-1203.
