Heterogeni jedrni RNP-ji in njihova vloga v celici
Uvod
Heterogeni jedrni ribonukleoproteini (hnRNP) so proteini družine RNA vezavnih proteinov. Poznamo 42 različnih vrst teh proteinov, ki so označeni od hnRNP A1 do hnRNP U. Razdeljeni so v 20 skupin s podobnimi lastnostmi. V hnRNP so bile opažene tri značilne domene, ki omogočajo vezavno na RNA; RNA prepoznavni motiv (RRM), RGG domena ter K-homologna domena (KH). Kombinacije različnih domen je razlog za visoko stopnjo heterogenosti proteinov te družine, najbolj poznane pa so lastnosti in funkcije hnRNP A1 in hnRNP A2/B1. hnRNP imajo pomembno vlogo tudi pri regulaciji celičnih procesov.
Domene
RGG
RGG domena je sestavljena iz ponavljajočih se tripeptidnih Arg-Gly-Gly motivov, med katerimi so hidrofobni in aromatski aminokislinski ostanki (te lahko sodelujejo pri dodatnih hidrofobnih interakcijah). Zaradi velike vsebnosti arginina, ki ima pozitiven naboj, se lahko RGG motiv nespecifično veže na RNA z elektrostatskimi interakcijami. Za interakcije je pomembna tudi sama struktura arginina, saj drugih pozitivno nabitih aminokislinskih ostankov v tem motivu ne najdemo. Arginin ima namreč tri amino skupine, ki lahko delujejo kot donorji H-vezi, hkrati pa planarnost gvanidinske skupine omogoča tvorbo π-interakcij. Pomembna je tudi prisotnost glicinskih aminokislinskih ostankov, saj ti omogočajo večjo fleksibilnost ogrodja v primerjavi z drugimi ostanki, s tem pa je konformacijska prilagodljivost domene večja. Kljub nespecifičnosti elektrostatskih interakcij, lahko te povečajo afiniteto proteina do RNA. Poleg nespecifične lahko tvori tudi specifično vezavo z RNA. Takšna vezava je posledica prepoznave sekundarnih in terciarnih struktur RNA in tvorbe vodikovih vezi z ogrodjem.
KH
K homologna domena (KH) je 70 aminokislinskih ostankov dolg strukturni element, ki se pojavlja v dveh različicah KHI navadno v evkariontih in KHII pogosteje v prokariontih. Čeprav vršita podobno funkcijo se razlikujeta predvsem v organizaciji sekundarne strukture. Vseeno pa jima je skupna fleksibilna z glicini bogata zanka ali GXXG motiv, ki prispeva k oblikovanju vezavnega žepa. V tem hidrofobnem predelu pride do prepoznave štirih nukleotidnih baz RNA ali ssDNA. Vezavna specifičnost je odvisna od GXXG motiva in lokalnega kemijskega proteinskega okolja.
RRM
RNA prepoznavni motiv (RRM) je najpogostejša domena za vezavo proteinov na RNA, ki prepozna kratka zaporedja dolga od 4 do 8 nukleotidov. Sestavljena je iz 80 do 90 aminokislin in ima značilno β1–α1–β2–β3–α2–β4 zgradbo, pri kateri štirje β-trakovi tvorijo antiparalelni β-list, obdan z dvema α-vijačnicama. RRM vsebuje dve visoko ohranjeni zaporedji RNP1 in RNP2, sestavljeni iz približno osmih in šestih aminokislinskih ostankov. RNP2 se nahaja na β1-traku, RNP1 pa na β3-traku. Obe vsebujeta aromatske in pozitivno nabite aminokislinske ostanke, ki tvorijo vezavno mesto za RNA. Aromatske omogočajo nalaganje baz RNA, kar stabilizira kompleks protein-RNA, pozitivno nabiti ostanki pa vzpostavljajo elektrostatske interakcije s fosfatnim ogrodjem RNA. Prisotnost več RRM domen v enem proteinu povečuje specifičnost in afiniteto vezave, kar je ključno za regulacijo procesov.
Funkcije hnRNP
Regulacija alternativnega izrezovanja
Alternativno izrezovanje je postranskripcijski regulacijski mehanizem, pri katerem iz ene pre-mRNA nastane več različnih mRNA transkriptov. Ta proces vključuje izpuščanje eksonov, uporabo alternativnih cepitvenih mest ali zadrževanje intronov. Ti mehanizmi omogočajo nastanek različno dolgih in sestavljenih transkriptov, kar vodi do sinteze strukturno in funkcijsko različnih proteinov.
Osnovni mehanizem izrezovanja poteka s pomočjo spliceosoma, dinamičnega kompleksa snRNP delcev U1, U2, U4, U5 in U6. Proces se začne z vezavo U1 na 5’ ter U2AF65 in U2AF35 na 3’ cepitveno mesto (kompleks E), nato se veže U2 (kompleks A) in vključi U4/U6•U5 (kompleks B). Po konformacijskih spremembah nastane katalitično jedro, kjer v dveh transesterifikacijskih reakcijah nastane lariat introna (kompleks C), eksona pa se povežeta. Proces je močno reguliran z RNA-vezavni proteini, med katerimi imajo pomembno vlogo hnRNP.
Heterogeni jedrni hnRNP večinoma delujejo kot inhibitorji izrezovanja na več različnih načinov. Prvi mehanizem vključuje spremembo prostorske zgradbe pre-mRNA. Vezava hnRNP na več ločenih mest RNA povzroči nastanek zanke, s čimer postanejo regulatorna zaporedja nedostopna za faktorje izrezovanja. Posledično je vezava spliceosoma otežena ali onemogočena, kar lahko vodi do izključitve eksona ali zadrževanja introna. Drugi mehanizem temelji na kompetitivni inhibiciji med RNA-vezavnimi proteini. hnRNP tekmujejo s SR proteini za vezavo na ista ali prekrivajoča se mesta na pre-mRNA. Medtem ko SR proteini spodbujajo vključitev eksonov z olajšanjem vezave spliceosomskih komponent, hnRNP delujejo inhibitorno in zmanjšajo učinkovitost njihovega vezanja. Končni izid izrezovanja je odvisen od ravnotežja med temi proteini. Primer je delovanje hnRNP A1, ki z vezavo na regulatorne regije tekmuje s SRSF1 in zavira vezavo U1 snRNP, kar vpliva na vključitev eksona. Tretji mehanizem vključuje maskiranje cepitvenih mest. Pri tem se hnRNP vežejo na regulatorne regije ali neposredno na cepitvena mesta, zaradi česar ta postanejo manj dostopna za spliceosomske komponente. Posledično je prepoznavanje cepitvenih mest oteženo, kar prepreči pravilno sestavljanje spliceosoma in zavre izrezovanje na tem mestu. Primer tega mehanizma je hnRNP I, ki z vezavo na polipirimidinske sekvence in interakcijo z U1 snRNP prepreči njegovo sodelovanje z U2 snRNP, kar lahko vodi v izključitev eksona.
Post-transkripcijska regulacija izražanja genov je eden izmed mehanizmov, ki prispeva k homeostazi celice. Vse mRNA so organizirane v določene regije, s katerimi interagirajo razni regulatorni proteini. Med pomembnimi področji za uravnavanje stabilnosti s hnRNP so poli-A rep, 3'UTR in znotraj te ARE regije (ang. “AU-rich elements«). hnRNP se vežejo na ta področja, pri čemer povečajo ali zmanjšajo stabilnost danega transkripta.
Vsem hnRNP ne moremo pripisati izključno stabilizacijskega ali destabilizacijskega delovanja, vendar pa večina preferenčno sodeluje pri določenem načinu regulacije. hnRNP A1 in A2/B1 sta dva izmed številnih predstavnikov, ki prispevata k destabilizaciji določenih mRNA. Ta proteina se z visoko specifičnostjo preko RRM domen vežeta na določene motive znotraj 3'UTR. Znano je, da ti isti motivi znotraj drugih regij (npr. introni, …) nimajo enake funkcije, saj njihova prisotnost v teh predelih ne vodi do takih regulatornih učinkov. Vezava hnRNP stabilizira vezavno platformo, kar omogoči interakcije CCR4-NOT kompleksa. To je eden izmed deadenilacijskih kompleksov evkariontskih celic, ki odstrani poli-A rep mRNA in jo s tem izpostavi faktorjem razgradnje. Poleg uravnavanja stabilnosti drugih mRNA, pa lahko hnRNP A2/B1 sodeluje tudi pri avtoregulaciji. Ko je tega preveč, pride do njegove vezave na lastno pre-mRNA in preko spremembe alternativnega izrezovanja sproži nastanek izooblik, ki so občutljive na razgradnjo. Dani proces ni edini, ki vodi do končne razgradnje mRNA. hnRNP D prepozna ARE motive znotraj 3'UTR in z vezavo teh omogoči sestavo ASTRC kompleksa, del katerega so razni proteini med katerimi je tudi poli-A vezujoč protein PABP. Ko se začne translacija ribosom odrine hnRNP D iz mRNA in tako sproščen se veže na PABP. Sledi njuna razgrajena v proteasomu, medtem ko se razkriti poli-A rep deadenilira.
V nasprotju z večinsko destabilizirajočim delovanjem pa določeni predstavniki te heterogene skupine lahko obvarujejo določene mRNA pred represivnimi mehanizmi. Poznanih je več načinov takšne regulacije, vendar lahko v splošnem govorimo o dveh. Pogosto pride do kompetitivne vezave na transkript, ki preprečujejo interakcije destabilizirajočih faktorjev ali pa preko uravnavanja delovanja komponent razgradnih poti. Značilen primer slednjega je hnRNP L, ki se veže znotraj 3′UTR in s tem omeji in zmanjša učinkovitost interakcije UPF1 z mRNA. Vezava UPF1 je sicer ključna za sprožitev in učinkovitost NMD poti (ang. »nonsense-mediated decay«), katere funkcija je uničenje potencialno okvarjenih mRNA.
Transport in translacija
RNA molekule, ki se prenesejo v citoplazmo vsebujejo cis-delujoče elemente. Cis delujoči elementi so krajše sekvence na DNA ali RNA, ki delujejo kot vezavno mesto za proteine, ki regulirajo ekspresijo genov. Te proteine imenujemo tudi trans delujoči faktorji. Nekateri hnRNP lahko delujejo kot trans-delujoči faktorji, kar pa omogoča sodelovanje hnRNP pri transportu RNA iz jedra.
Primer takšnega hnRNP je hnRNP A1. Transport omogoča M9 signalna sekvenca, ki deluje kot signal za transport v in izven jedra. Transport v jedro uravnava receptor transportin 1 (TNPO1). Vezava hnRNP A1 na transportin 1 v citoplazmi povzroči prenos kompleksna v jedro preko NPC (jedrni porni kompleks), v jedru pa nato pride do vezave RanGTP na transportin, kar povzroči odcepitev hnRNP A1. TNPO1-RanGTP kompleks nato potuje nazaj v citoplazmo, kjer preko RanGAP pride do hidrolize GTP v GDP, kar povzroči sprostitev transportina 1.
Transport iz jedra še ni dobro razumljen, vendar je najverjetneje uravnavan s posttranslacijskimi modifikacijami (PTM). Pokazano je bilo, da je transport hnRNP Npl3p (protein prisoten v kvasovkah in je po zaporedju soroden hnRNP A1) odvisen od metilacije. Za učinkovit transport je potrebno maskiranje RGG tripeptidov, to pa omogoči metilacija arginina v RGG. Ta modifikacija ne vpliva na zmožnost vezave proteina na mRNA, vendar v njeni odsotnosti Npl3p z mRNA ne more tvoriti kompleksa, ki bi lahko izhajal iz jedra oziroma ta kompleks ni zmožen tvoriti interakcij s proteini, ki nadzirajo transport.
hnRNP A1 pa lahko vpliva tudi na samo translacijo mRNA, ker lahko deluje kot trans-delujoči faktor, ki veže IRES (notranje vstopno mesto za ribosom). Ta lastnost omogoča uravnavanje vezave ribosoma in s tem translacijo. Po prenosu mRNA v citoplazmo lahko pride do fosforilacije hnRNP A1, ki pa povzroči izpostavitev IRES, kar omogoči od 5’ kape neodvisno translacijo. Vezava ribonukleoproteina na IRES sekvenco mRNA naj bi tudi pospešila transport mRNA v citoplazmi.
Zaključek
hnRNP so funkcijsko in strukturno raznolika družina RNA-vezavnih proteinov, ki preko treh vezavnih domen RRM, KH in RGG prepoznajo tarčne mRNA. Sodelujejo pri glavnih regulatornih mehanizmih, ki celici zagotavljajo natančen nadzor nad procesiranjem primarnih transkriptov, nadaljnjim transportom v citoplazmo in pa nenazadnje tudi samim uravnavanjem stabilnosti mRNA. To dokazuje, da je ta edinstvena skupina ključna za nemoteno izražanje celičnega genoma ter za razumevanje kompleksnih mehanizmov posttranslacijske regulacije.
Viri
1. Z. Li, H. Wei, D. Hu, X. Li, Y. Guo, X. Ding, H. Guo, L. Zhang: Research Progress on the Structural and Functional Roles of hnRNPs in Muscle Development. Biomolecules 2023, 13, 1434. DOI: 10.3390/biom13101434
2. A. Kishor, Z. Ge, J. R. Hogg: hnRNP L‐dependent protection of normal mRNAs from NMD subverts quality control in B cell lymphoma. EMBO J 2019, 38, e99128. DOI: 10.15252/embj.201899128
3. J. P. Clarke, P. A. Thibault, H. E. Salapa, M. C. Levin: A Comprehensive Analysis of the Role of hnRNP A1 Function and Dysfunction in the Pathogenesis of Neurodegenerative Disease. Front. Mol. Biosci. 2021, 8. DOI: 10.3389/fmolb.2021.659610
4. Z. Zhu, X. Wu, Y. Hu, X. Bian, Y. Wang, Q. Zhu: Alternative Splicing: Molecular Mechanisms, Biological Functions, Diseases, and Potential Therapeutic Targets. MedComm 2025, 6, e70545. DOI: 10.1002/mco2.70545
5. M. K. Hasan, L. Jeannine Brady: Nucleic acid-binding KH domain proteins influence a spectrum of biological pathways including as part of membrane-localized complexes. Journal of Structural Biology: X 2024, 10, 100106. DOI: 10.1016/j.yjsbx.2024.100106
