Identification and mapping of clone-specific chromosomal abnormalities

METODA ZA DOLOČEVANJE NOVIH MOLEKULSKIH MARKERJEV ZA DOLOČANJE MINIMALNIH PREOSTANKOV BOLEZNI PRI PACIENTIH Z AKUTNO LEVKEMIJO

UVOD

Akutna levkemija je vrsta levkemije, ki prizadene nezrele in slabo diferencirane celice. Posledice bolezni so huda anemija, krvavitve ter povečana vranica in bezgavke. Prav tako pacienti z akutno levkemijo umrejo v nekaj mesecih. Poznamo 2 tipa akutne levkemije: limfocitno levkemijo (ALL) in mieloidno levkemijo (AML). Vse te kromosomske mutacije, aberacije in genske preurejenosti lahko senzitivno in kvantitativno detektiramo s pomočjo opazovanja minimalnih preostankov bolezni (MRD) celic, ki jih je prizadela levkemija. Ta način opazovanja z levkemijo prizadetih celic se je izkazal za zelo pomembnega, saj lahko napovemo kakšna bo kakovost odziva na zdravljenje, čas popolne remisije in napoved individualnega tveganja za ponovitev bolezni. V zadnjem času se je PCR v realnem času izkazal kot občutljiv in specifičen ter s tem najbolj primeren za diagnosticiranje akutne levkemije in ocenjevanja minimalnih preostankov bolezni. Vendar se je ta metoda izkazala za neprimerno v primeru, da pacientu ne dokažemo nobene od prej naštetih kromosomskih aberacij. Zato je pomembno, da identificiramo nove klonsko specifične markerje pri celicah prizadetih z levkemijo, ki bi jih lahko spremljali z opazovanjem MRD.

METODE IN REZULTATI

MOLEKULARNA CITOGENETSKA ANALIZA, KROMOSOMSKO MIKROSICIRANJE IN DOP-PCR Analizirali so celično linijo K562 in kostni mozeg ter periferno kri iz štirih pacientov. Kariotip celične linije kot tudi kostnega mozga in krvi na prelomih kromosomov je bil izveden z multipleksno fluorescenco in situ hibridizacijo in metodami barvanja kromosomov (mFISH in mBAND). Ti metodi barvanja kromosomov pobarvata različne predele posameznega kromosoma z različnimi barvami in tako omogočata boljše nadaljnje analize posameznih predelov kromosomov, ki so jih Jancuskova in sodelavci potrebovali. Kromosome so mikrosicirali na regijah v bližini njihovih prelomov. Tako so dobili fragmente kromosomov, ki so vsebovali prelomni del kromosoma. Nato so tem fragmentom dodali izbrano raztopino in jih pripravili za pomnoževanje z DOP PCR (angl. degenerate oligonucleotide-pirmed PCR).

SEKVENCIRANJE NASLEDNJE GENERACIJE IN LR-PCR Nukleotidno zaporedje so določali z GS Junior sistemom. Katerega so nato primerjali med seboj z referenčnim zaporedjem in nato sestavili nove oligonukleotide za LR-PCR (PCR z velikim območjem). Na podlagi tega so naredili oligonukleotide primerne za PCR v realnem času za opazovanje minimalnih preostankov bolezni celic, okuženih z levkemijo.

REZULTATI

CELIČNA LINIJA K562 Po mikrosiciranju so dobili 11 fragmentov, ki so jih pomnožili z DOP-PCR. Po določanju nukleotidnega zaporedja z GS Juniorjem so dobili 80798 rezultatov, ki so jih analizirali, kjer jim je za referenčno sekvenco služil kromosom 3 in 10. Ker nukleotidno zaporedje ob prelomu v kromosomu 3 in 10 ni dokončno znano so na koncu dobili malo primernih zaporedij na podlagi katerih so nato naredili LR-PCR. Po zadnjemu PCR so dobili 4,5 kb dolg produkt. Ta produkt so bili geni CDC25A na kromosomu 3 in GRID1 na kromosomu 10.

PACIENT 1 Prišlo je do fuzije genov MLL-AF4. To je bilo potrjeno s strani PCR v realnem času kot tudi s strani sekvenciranja. Prav tako so naredili vse analize, ki so bile prikazane na celični liniji. Po sekvenciranju so dobili 122279 rezultatov za kromosom 4 in 120209 rezultatov za kromosom 11. Rezultat LR-PCR sta bila 0,5 kb (kromosom 4) in 3 kb (kromosom 11) dolg produkt. Pri tem pacientu je derivat kromosoma 4 vseboval zlitje psevdogena LOC392539 iz kromosoma X in AF4 gena iz 4q21.

ZAKLJUČEK Kombinacija citogenetskih in molekularnih metod, naj bi bila najboljše orodje za identifikacijo novih markerjev. S pomočjo citogenetskih metod se namreč poišče lokacijo kjer se nahaja mutacija, z molekularnimi tehnikami pa pridobimo njihovo sekvenco in kvantifikacijo MRD. Metoda PCR v realnem času z kvantificiranjem MRD bi se lahko uporabljala direkten in hiter prikaz kromosomskih aberacij pri pacientih. V primerjavi z mapiranjem s pomočjo FISH, nam naša tehnika omogoča vpogled v nukleotidno zaporedje preiskovane regije in s tem določitev genov, ki se tu nahajajo. Celoten postopek od odvzema vzorca do PCR v realnem času s pomočjo MRD testa ne traja dolgo (6 tednov), zato bi to v klinični praksi lahko uporabljali kot orodje personalizirane medicine.

VIR: Jancuskova T., Plachy R., Stika J., Zemankova L., W. Hardekopf D., Liehr T., Kosyakova N., Cmejla R., Zejskova L., Kozak T., Zak P., Zavrelova A., Havlikova P., Karas M., Junge A., Ramel C., Pekova S. (2013). A method to identify new molecular markers for assessing minimal residual disease in acute leukemia patients. Leukemia Research. 37, 1363-1373