Inženiring Cyborg bakterij preko intracelularne hidrogelacije
Povzeto po članku: Luis E. Contreras-Llano et al. Engineering Cyborg Bacteria Through Intracellular Hydrogelation, Advanced Science, 2023, 10, 2204175, 1-11.
Uvod
V zadnjem času so se tehnologije, ki združujejo žive celice z umetnimi materiali močno razvile. Ena izmed najnovejših raziskav na področju sintezne biologije in biotehnologije so t.i. Cyborg celice, ki so sposobne opravljati naloge, katerih žive celice ne bi mogle. Imajo velik potencial pri uporabi v številnih aplikacijah.
Naravne celice lahko opravljajo zapletene naloge s pomočjo sintetičnih genskih konstruktov, vendar njihovo avtonomno podvajanje pogosto povzroča pomisleke glede varnosti njihove uporabe v biomedicinskih aplikacijah. Nasprotno pa umetno narejene celice, ki temeljijo na materialih, ki niso zmožni podvajanja, zagotavljajo bolj nadzorovano delovanje, čeprav imajo zmanjšano biokemično kompleksnost. Luis E. in sod. so prvič ustvarili hibridne Cyborg celice s pomočjo znotrajcelične hidrogelacije. Sintetične celice vsebujejo polimerno mrežo, zaradi katere se ne morejo deliti, ohranjajo pa bistvene celične funkcije, kar bi lahko izkoriščali za različne namene[1].
Cyborg celice
Cyborg celice imenujejo žive celice, ki so bile modificirane z umetnimi sredstvi, kot so na primer nanodelci ali hidrogeli, s ciljem izboljšati njihove lastnosti ali jim dati nove sposobnosti, ki presegajo naravne lastnosti celic. So nov razred biomaterialov, ki vključujejo enocelične mikroorganizme in izolirane celične kulture, prevlečene z različnimi polimernimi nanofilmi, nanodelci ali kombinacijo obojega. To omogoča združitev biološke funkcije celic z funckionalnostjo nanodelcev[2].
Biomikrostoji pogosto nastanejo iz gensko spremenjenih živih celic, saj imajo slednje edinstveno prednost, da so zelo prilagodljive in vsestranske. Do danes so bile žive celice uspešno spremenjene za široko paleto aplikacij, kot so živi terapevtiki, bioremediacija ter dostava zdravil in genov. Problem pa se kaže v tem, da nastale sintetične žive celice težko nadzorujemo zaradi njihovega nenehnega prilagajanja in stalno razvijajočih celic, kar predstavlja skrb glede varnosti njihove uporabe. Po drugi strani pa nežive sintetične celice lahko ustvarimo z uporabo sintetičnih materialov, kot so polimeri in fosfolipidi. Takšni biomimetični sistemi imajo več prednosti, saj so za njih značilne predvidljive funkcije, toleranca na nekatere okoljske stresorje, možnost spodbujanja protitumorskih imunskih odzivov, komuniciranja z drugimi celicami, posnemanja imunskih celic in izvajanja fotosinteze. V nasprotju z živimi celicami pa imajo neživi sistemi omejeno biokemično kompleksnost in biološke funkcije[1].
Luis E. in sod. opisujejo ustvarjanje polživih celic, ki imajo lastnosti tako inženirsko ustvarjenih celic, kot kompleksno funckionalnost naravnih celic. Pokazali so, kako lahko zamreženje hidrogela znotraj bakterijske citoplazme pod posebnimi pogoji ustvari metabolno aktivne celice, ki niso zmožne replikacije. Prav zato ustvarjene celice ne morejo onesnažiti ekosistemov kot bi to storile žive sintetične celice. Poleg tega pridobijo nove sposobnosti upiranja stresorjem ki bi sicer ubili naravne celice[1].
Inženirstvo Cyborg celic z znotrajcelično hidrogelacijo
Z modifikacijo s sintetičnim materialom so naravne bakterijske celice spremenili tako, da so ohranile zmogljivost vendar pridobile izboljšane lastnosti. Ohranile so se ključne značilnosti živih celic, vključno z celičnim metabolizmom, sintezo beljakovin, pretočnostjo membran in funkcionalnostjo membranskih proteinov[1].
Bakterijam E. coli so vlili kemično stabilen in nerazgradljiv sintetični hidrogel z nizko biološko reaktivnostjo. Hidrogel je bil sestavljen iz poli(etilen glikol) diakrilarnega monomera (PEG-DA; Mn 700) in 2-hidroksil-4'-(2-hidroksietoksi)-2-metilpropiodenona. Kot fluorescentno barvilo so vključili fluorescein O'O-dikrilat, da so preverili prepustnost hidrogelacijskih komponent v bakterije in uspešnost intracelularne hidrogelacije. Infuzijo bakterijskih celic s komponentami hidrogela so izvedli z uporabo enega cikla zamrzovanja in odmrzovanja. Po uspešni infuziji so celice spirali, da so odstranili ekstracelularne komponente hidrogela in celične ostanke. Znotrajcelične monomere PEG so sprožili z uporabo ultravijolične svetlobe (UV-A), ki je bila namenoma izbrana tako, da ni poškodovala DNA in drugih bioloških komponent. Po obsevanju z UV-A so nastale bakterijske celice inkubirali v bogatem mediju (37 °C, 250 rpm/min) in jih obdelali s karbenicilinom, da bi uničili podvajajoče se celice. Dodatek karbanicilina je odstranilo bakterijske celice, ki niso bile uspešno hidrogelirane, zato je nastala populacija Cyborg celic, ki niso sposobne delitve. Za potrditev uspešne hidrogelacije so hidrogelirane (+UV) in nehidrogelirane (-UV) celice obdelali še z 1 % SDS z namenom testiranja stabilnosti bioloških membran. Hidrogelirane celice so ohranile svojo zeleno fluorescenco, medtem ko nehidrogelirane celice niso[1].
Rezultati študije
Raziskovalci so uspešno zamrežili PEG hidrogele znotraj bakterij, kar so identificirali s fluorescenčnim slikanjem na osnovi barvila (ang. Dye-based fluorescence imaging). Nato so izvedli še različne funkcijske teste.
S testom nastajanja kolonij (ang. Colony Forming Unit assay, CFU) so pregledali replikacijsko sposobnost hidrogeliranih bakterij. Primerjali so število CFU, pridobljeno iz hidrogeliranih celic (obdelanih z UV žarki) in divjih celic (izvirne nehidrogelirane bakterije). Poskusi so dokazali, da v 6 dneh sledenja CFU, Cyborg celice niso pokazale nobenih zaznavnih kolonij. Medtem, ko so celice divjega tipa z dvema razredčitvama zrasle do ravni visoke gostote. Rezultati so potrdili, da lahko proizvedemo populacijo intracelularnih hidrogeliranih bakterij, ki niso zmožne delitve[1].
Presnovno aktivnost Cyborg celic so ocenili z uporabo reagenta za celično viabilnost, ki nam pove zmanjšanje moči živih celic, kar je običajno povezano s stanjem celičnega metabolizma. Prvi dan so imele ustvarjene Cyborg celice 70 % presnovno aktivnost, brez zaznavne celične rasti. Nadaljni poskusi so pokazali, da narejene Cyborg celice ohranjajo merljivo presnovno aktivnost do tri dni, kar ustreza 150 delitvenim ciklom naravnih bakterij. Žive celice so ohranile konstantno presnovno aktivnost med trajanjem poskusa[1].
Poleg replikacijske sposobnosti in metabolične aktivnosti Cyborg celic so raziskovalci želeli ohraniti fluidnost membran, ki je povezan s pravilnim delovanjem in sposobnostjo preživetja bakterijskih celic. Izvedli so test obnovitve fluorescence po fotobeljenju (ang. Fluorescence recovery after photobleaching, FRAP). Uporabili so lipofilno barvilo DiD in ocenili stanje lipidnih membran. Celice Cyborg in neobdelane celice so pokazale podobne razpolovne čase okrevanja po fotobeljenju[1].
Prav tako so dokazali, da lahko ta znotrajcelični protokol hidrogelacije proizvede Cyborg E. Coli ne glede na genetsko zasnovo testranih sevov. Protokol so testirali na dveh različnih sevih z različnimi genotipi; E. Coli BL21(DE3) in probiotičnem sevu Nissle 1917[1].
Poleg vseh navedenih funkcij so si raziskovalci želeli ohraniti sposobnost izražanja proteinov v Cyborg celicah, saj to omogoča njihovo funkcionalnost za različne aplikacije. Za oceno so uporabili sev E. coli BL21(DE3), ki je vseboval plazmid, ki nosi zapis za fluorescentni reporter mOrange pod nadzorom hibridnega promotorja PT7-lacO. Slike fluorescenčne mikroskopije so pokazale, da Cyborg celice izražajo mOrange kot odgovor na indukcijo različnih majhnih molekul. Celice so izrazile 70% celotne količine mOrange, ki jo proizvedejo celice divjega tipa, kljub temu, da niso pokazale celične rasti[1].
Z masno spektrometrijo (MS) so analizirali proteinsko sestavo celic, da bi identificirali ključne spremembe proteoma zaradi odziva na hidrogelacijo. Analiza je pokazala, da imajo narejene Cyborg celice drugačen proteomski profil od nespremenjenih celic. Profil proteoma nakazuje, da hidrogelacija posredno spremeni sestavo beljakovin, ki sodelujejo pri presnovi, sintezi in sestavljanju beljakovin[1].
Cyborg celice so funkcionalizirali z uporabo knjižnice senzorjev majhnih molekul iz zbirke Marionette Sensor Collection. Preučili so ali je celice mogoče hitro funkcionalizirati z različnimi sintetičnimi biološkimi deli. Ustvarili so 12 sevov, ki se odzivajo na majhne molekule. Nato so jih hidrogelirali, da so ustvarili Cyborg celice, ki so odzivne na 12 induktorjev. Za reporterski protein so uporabili rumeni fluorescenčni protein (ang. Yellow Fluorescent Protein, YFP). Vsi sevi Cyborg Marionette so sčasoma pokazali povečano izražanje YFP v prisotnosti vsakega induktorja. Ti rezultati skupaj kažejo, da je Cyborg celice mogoče funkcionalizirati z raznolikim naborom sintetičnih bioloških delov in jih zlahka ustvariti iz obstoječih sintetičnih celic[1].
Hidrogelirane Cyborg celice pridobijo nove sposobnosti upiranju stresorjem ki bi sicer ubili naravne celice. S fluorescenčno mikroskopijo so dokazali, da so narejene celice odporne proti hiperoksidnem okolju, ki vsebuje vodikov peroksid (H2O2). To ima velik pomen, saj je H2O2 bistvena kemična komponenta obrambe gostitelja in mehanizmov razgradnje v celicah sesalcev. Sintetični hidrogel torej zagotavlja določeno stopnjo zaščite pred škodljivimi snovmi, ki bi sicer ubile naravne celice. Poleg tega so dokazali odpornost Cyborg celic na antibiotike, ki ciljajo celično steno in njihovo stabilnost tudi v medijih z visokim pH (pH nad 7), kar kaže bistven pomen za biomedicinske in industrijske aplikacije[1].
Uporaba v terapevtske namene
Ena glavnih priložnosti sintezne biologije v biomedicini je dostava terapevtikov s tumorsko invazivnimi bakterijami. V ta namen so izdelali Cyborg celice, ki lahko napadejo sesalske celice s pomočjo proteina invazina, ki sodeluje pri adheziji in invaziji sesalskih celic, ko je izražen v E. coli. Poskusi in vitro so potrdili uspešno invazijo rakavih celic z omenjenimi konstrukti. Test je pokazal, da so Cyborg celice, ki izražajo invazin in mOrange, lahko napadle 34 % celic SH-SY5Y (celična linija, ki izhaja iz nevroblastoma) v primerjavi s 15 % celične invazije s Cyborg celicami, ki ne izražajo invazina. Poleg tega so dokazali invazijo celic HeLa (celična linija iz adenokarcinoma) s pomočjo Cyborg celic, z izraženim invazinom. Medtem ko fiksne bakterijske celice tega niso bile zmožne[1].
Zaključek
V študiji so dokazali, da infuzija komponent hidrogela v bakterijske celice, v nasprotju s pričakovanji, omogoči skrben nadzor znotrajceličnega sestavljanja sintetičnega polimernega matriksa. Nastale Cyborg celice ohranjajo celične funkcije kot so izražanje beljakovin, metabolizem, pretočnost membrane, medtem ko je njihova replikacija onemogočena. Prav tako jim znotrajcelični hidrogel podarja funkcionalno odpornost na okoljske stresorje, kot so visok pH, vodikov peroksid in antibiotiki. Dodatne raziskave na tem področju bi lahko razširile uporabo Cyborg celic za aplikacije in vivo, kot so antibakterijsko zdravljenje, biosenzorji, modulacije črevesnega mirkobioma in zdravljenje raka. Prav tako imajo opisane lastnosti Cyborg celic, predvsem zaradi odpornosti na okoljne stresorje, velik potencial da postanejo nov razred sintetično terapevtske dostave zdravil[1]
Literatura
[1] Luis E. Contreras-Llano et al. Engineering Cyborg Bacteria Through Intracellular Hydrogelation, Advanced Science, 2023, 10, 2204175, 1-11.
[2] Rawil F. Fakhrullin et al. Cyborg cells: functionalisation of living cells with polymers and nanomaterials, Chemical Society Reviews, 2012, 41, 4189-4206.
