Inducirane pluripotentne celice iz mišjih fibroblastov

Okrajšave

• ES- embrionic steam (zarodne matične)

• iPS- induced pluripotent steam (inducirane pluripotentne matčne)

• MEF- mouse embryonic fibroblasts (mišji embrionalni fibroblasti)

• RT-PCR- real-time PCR

Povzetek

Diferencirane somatske celice lahko reprogramiramo v pluripotentne s prenosom jedra somatske celice v neoplojeno oocito ali z združitvijo somatske celice z embrionalno matično celico. Oba načina aktivirata izražanje specifičnih, tihih genov. Najnovejši način ponovne vzpostavitve pluripotentnosti pa je dodatek 4 faktorjev somatski celici: Oct3/4, Sox2, c-Myc in Kf4. Z njimi dobimo iPS, ki imajo ES-morfologijo (okrogle, veliko jedro in malo citoplazme) in izražajo ES markerske gene. ES so celice, ki ohranjajo pluripotentnost in jih prepoznamo po značilnostih: tvorijo embrionalna telesa, se lahko razvijejo v vse celične tipe in v teratom. Hipoteza: faktorji, ki vzdržujejo pluripotentnost, jo najbrž tudi inducirajo.

Rezultati

Po gornji hipotezi so izbrali 24 genov. Fbx15 je promotor, ki se specifično izraža v ES, v stanju pluripotentnosti. Pokazatelj aktiviranega promotorja oz. gena je beta-galaktozidaza in odpornost na neomicin ter G418. Indukcija pluripotentnosti se je pokazala kot odpornost na G418.

Najprej so z virusno transdukcijo vnesli cDNA (mRNA-ju komplementarno DNA) vseh 24 kandidatov v MEF. Celice so bile nato gojene na STO (STO; S: SIM, T:6-tiogvanin, O: ovabin odporne embrionalne mišje celice) hranilnih celicah v koncentraciji G418 = 0,3 mg/mL. S transdukcijo vseh 24 genov so dobili 22 v prvem in 29 G418-odpornih kolonij v drugem poskusu z ES morfologijo in podvojevalnim časom. Označili so jih z iPS-MEF24 (vseh 24 genov). V vseh so bili izraženi ES markerji (Oct3/4, Nanog,..). Kateri od teh 24 so ključni? Ponovili so eksperiment tako, da je vsakič manjkal po en faktor. V primeru desetih faktorjev, odpornih kolonij ni bilo več, če je odvzeti faktor manjkal. Izbor faktorjev so ponovno zoožili z umikom po enega faktorja izmed desetih. G418-odpornih kolonij ni bilo, če ni bilo Oct3/4 ali Kf4. neznatno število kolonij je nastalo brez Sox2 in niso imele ES morfologije, če ni bilo c-Myc. Torej so ti štirje ključni. Z iPS-MEF4 so poimenovali kolonije s kombinacijami štirih in z iPS-MEF10 kombinacije desetih cDNA. Obe seriji kolonij sta na RT-PCR pokazali, da kolonije izražajo ES markerske gene.

Tudi v primeru kombinacije treh faktorjev (kolonije poimenovane iPS-MEF3) je nastalo nekaj G418-odpornih kolonij, vendar se pluripotentnost ni obdržala oz. je aktivirala Fbx15 lokus (v primeru Okt3/4, Kf4, c-Myc), a ni imela ES morfologije. IPS-MEF3 kolonije so izražale druge gene kot tiste s štirimi in desetimi geni. Pri kombinacijih dveh faktorjev ali uporabi samo posameznega faktorja iPS kolonije niso nastale.

Analiza je pokazala, da so iPS podobne, a ne identične ES. Prvič, iPS so izražale večino genov, značilnih za ES, ne pa vseh (to je pokazal RT-PCR in pregled globalnega izražanje DNA z mikročipi ). Drugič so se iPS nahajale v gručah ločeno od fibroblastov in blizu, vendar še vedno ločeno od ES. Tretjič je kromatinska imunoizzvalna analiza pokazala, da sta ostala promotorja Oct3/4 in Nanog nepopolno demetilirana in histoni acetilirani. Pri iPS- MEF3 pa so bili izraženi drugi geni kot pri 4 in 10. Vse kaže na to, da so iPS celice ujete v nekem stanju med ES in somatskimi celicami.

Pluripotentnost so raziskovali z teratomom (tumor iz vseh 3 vrst zarodnih plasti). Pojavili so se v iPS-MEF4 in 10. Plasti so identificirali z imunooznačevanjem z markerji (aktin za mezoderm, alfa-fetoprotein za endoderm in betaIII tubulin za ektoderm). Tudi pri iPS-MEF3 so se razvili tumorji, vendar iz nediferenciranih celic. Kombinacija Oct3/4, c-Myc in Kf4 torej izražajo ES markerske gene, ampak so nulipotentni (ne inducirajo pluripotentnosti).

iPS niso ostale nediferencirane brez hranilnih STO celic, zato ni možno, da so iPS zgolj kontaminacija prej obstoječih ES celic.

Faktorja

c-Myc

c-Myc protein pospeši proliferacijo celic in zavira njihovo diferenciacijo. Nereguliran povečuje genomsko nestabilnost, spodbuja metastazo in celično rast. Izguba c-Myc proteina tako ne vodi le do izgube celične proliferacije in rasti, ampak pospeši tudi diferenciacijo in povzroči prekomerni odziv na poškodbe DNA. C-Myc namreč nadzoruje veliko število genov. Prav zaradi njegove pomembne funkcije lahko c-Myc povzroči tudi apoptozo celice. C-Myc lahko pomaga preživeti celicam zaradi prekomernega odziva, sej če pride do mutacij na onkogenih, se le-te na prenašajo naprej. Pomanjkanje c-Myc lahko pripelje do nastanka tumorjev.

Klf4

Klf4 (Krüppel-like factor 4) je transkripcijski faktor, ki lahko aktivira in utiša gene, potrebne za regulacijo celičnega cikla in diferenciacije. Med geni, ki jih regulira Klf4 je veliko takšnih, ki inhibirajo proliferacijo pospešenih, medtem ko so tisti, ki pospešujejo proliferacijo represiranih. Torej Klf4 predvsem inhibira celično profireracijo. Pomanjkanje Klf4 preprečuje terminalno diferenciacijo epitelijskih celic (smrt fetusa). Tako je Klf4 inhibitor proliferacije med stresom in diferenciacijo, kar pomeni, da ima Klf4 tumor zavirajočo funkcijo. Vendar pa so v 70 % tumorskih celicah odkrili preveč Klf4, kar nasprotuje prejšnjim ugotovitvam. Klf4 lahko zamenja svojo funkcijo iz zaviralca rasti (in s tem zaviralca tumorskega nastanka) v pospeševalca rasti onkogena. Klf4 zavira direktno p53 (o.p. protein 53 zavira nastanek tumorjev z inhibicijo celičnih procesov. Je eden glavnih nadzornikov celičnih poti, njene apoptoze, zaustavljanje njene rasti in popravljanju DNA. Sodeluje tudi pri aktivaciji onkogenov in hipoksiji. Pri >= 50% tumorjev je gen za p53 mutiran oz. manjka.) prek njegove promotorske regije. Vendar ga ne zavira prek ubikvitinacije kot ga ostali encimi, ampak se skupaj z njim veže na specifičen element. S tem prav tako deaktivira p53, in vodi v nastanek tumorskih celic.

Torej je Klf4 inhibitor apoptoze, ki jo povzroči c-Myc (zavira ekspresijo p21CIP2, ki zavira celično proliferacijo). Za generacijo iPS celic je tako zelo pomembna uravnoteženost teh dveh faktorjev.

Razprava

Samo 0,02% celic z vsemi štirimi faktorji je postalo iPS celic. Kar pomeni, da se samo redka tkiva v fibroblastih lahko razvijejo do iPS celic. Ena izmed razlag, zakaj se samo tako majhen odstotek razvije do iPS celic, je takšna, da ti štirje faktorji spremenijo tkiva tako, da se ne morajo razviti. Zanimivo je, da je tak učinek tudi v kostnem mozgu, kjer bi moralo biti več iPS celic.

Zakaj nastane tako malo celic? Število štirih faktorjev za nastanek nove generacije iPSC je natančno omejeno in samo majhno število celic, ki imajo te štiri faktorje v primernih koncentracijah je ES celic. To idejo potrjuje dejstvo, da sprememba Oct3/4 faktorja za 50 % povzroči diferenciacijo ES celic. iPS kloni so tako imeli preveč faktorjev, vendar je bila njihova proteinska stopnja enaka tisti v ES celicah. Iz tega lahko sklepamo, da imajo iPsc kloni mehanizem, ki regulira proteinske ravni teh štirih faktorjev. Velika stopnja štirih faktorjev je potrebna v začetni fazi generacije iPS celic, vendar ko enkrat dosežejo podoben status kot v ES celicah, delujejo inhibitorno na samoobnovitvene procese. Zelo malo transdukcijskih celic se zato lahko samoobnovi.

Generacija pluripotentnih celic potrebuje dodatne kromosomske spremembe, ki se naredijo spontano ali pa s pomočjo teh štirih faktorjev. (Na zmanjšanje kromosomskih aliteracij lahko vplivajo tudi retrovirusi. Vsak klon ima cca. 20 retrovirusnih integracij, kateri lahko povzročijo utišanje ali fuzijo z nekaterimi endogeni. Za natančno določitev začetka iPS celic pa bodo potrebne nadaljnje študije.)

Ne vemo še, če so ti štirje faktorji (Sox2, Oct3/4, c-Myc in Klf4) vsebovani tudi pri reprogramiranju induciranem s fuzijo ES celic ali jedrnim transferjem v oocite. Saj dokler so ti štirje faktorji v ES celicah na visoki ravni lahko predvidevamo, da so vključeni v mehanizem za reprogramiranje v ES celicah, ki je v jedru. iPS celice niso identične ES celicam, kar lahko dokažemo tudi z globalnim izražanjem genov in DNA metilacijskim statusom. (Vendar niso prepričani, da niso zgrešili dodatnega faktorja, ki bi bil lahko ECAT1, čeprav ne regulira ES markerskih genov.)

Bolj nejasna je vloga štirih faktorjev (predvsem Klf4 in c-Myc) v reprogramiranju v oocitah. Oba sta namreč pogrešljiva v nastajanju mišjega zarodka. C-Myc ni zaznan tudi v oocitah. (l-myc, Klf7, Klf 17 so v mišjih jajčecih, medtem ko Klf4 in c-Myc nista prisotna.) Klf4 in c-Myc sta verjetno nadomeščena s temi podobnimi proteini. Verjetno so tudi ostali faktorji potrebni za kompletno reprogramiranje v oocitah.

Od transgenov so potrebni ti štirje faktorji za nastanek iPS celic, čeprav stopnja Oct3/4 in Sox2 iz endogenih genov ostaja nizka. iPS kloni vsebujejo veliko loxP delov na večih kromosomih, kar pomeni, da Cre-regulirana rekombinacija ne bo povzročila samo delecije transgenov ampak tudi inter in intrakromosomske prerazporeditve. Za odgovor na to vprašanje bodo potrebne še nadaljnje študije z različnimi kondicijskimi sistemi, kot je tetraciklin posredovan sistem (tetracycline-mediated system). iPS celice lahko diferencirajo in vitro in in vivo, če celice vsebujejo te štiri faktorje. Oct3/4 in Sox2 proteina zaznavno upadata tekom in vitro diferenciacije celic. Retrovirusno izražanje se zmanjša v ES celicah in je utišano z diferenciacijo epigenetskih modifikacij, kot je DNA metilacija. iPS celice imajo mehanizem, ki zmanjša število Nanog in ostalih trangenih proteinov. Ta mehanizem lahko deluje tudi tekom diferenciacije celic, vendar ga samega po sebi še ne razumemo.

Najzanesljivejša metoda za ugotavljanje pluripotentnosti je tetraploidni blastocitni dopolnjevalni test, pri katerem embrionalno (ES ali iPS) celico združijo z neembrionalno (tetraploidno). Če se zarodno tkivo razvije v odraslo, se potrdi reprogramiranje (pluripotentnost) embrionalne celice.

Enake raziskave z enako kombinacijo faktorjev potekajo tudi na človeških embrionalnih celicah. Uporaba enakih faktorjev za miš in človeka nakazuje, da je pluripotentnostni mehanizem zelo konzervativen. Bolj natančne analize iPS celic bodo povečale naše razumevanje transkripcijske regulacije v pluripotentnih zarodnih celicah.

Viri

• Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent steam cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 2006. Št. 126. Str. 663-676

• Rodolfa K. T., Eggan K., Transkriptional logic for nuclear reprogramming. Cell. 2006. Št. 126. Str 652-655

• Adhikary S., Eilers M.. Transcriptional Regulation And Transformation By Myc Proteins. Molecular Cell Biology. 2005. Št. 6. Str. 635-645

• Rowland B.D. in sod. The KLF4 tumour suppressor is a transcriptional repressor of p53 that acts as a context-dependent oncogene. Nature Cell Biology. 2005. Letn. 7. Št. 11. Str. 1074-1082