Integracija okoljskih signalov z modularnimi IN vrati
(Dominik Dekleva)
Uvod
Bakterije uporabljajo različne mehanizme za spremljanje okoljskih signalov; dvokomponentne sisteme, transkripcijske faktorje in male RNA. V določenih primerih je okolje definirano z enim signalom, kot je prisotnost ali odsotnost male molekule (operoni lac, trp, fur). V drugih primerih je potrebna integracija več različnih signalov za specifično zaznavanje okolja. Tudi signali, ki so sami po sebi preveč splošni za karekterizacijo okolja (pH, temperatura, osmolarnost) lahko delujejo specifično v kombinaciji. Podoben problem nastane, ko programiramo celice za identifikacijo okolja, ki ni naravno prisotno in nima enega dominantnega signala. V teh primerih so pomembna logična vrata za integracije več signalov in uspešno identifikacijo okolja.
Leta 2007 so prvič v E. coli uspešno vnesli sistem logičnih IN vrat, katerega pomembna lastnost je modularnost. Mikroorganizmi uporabljajo genetska vezja za integracijo okoljskih informacij. V tej študiji so pripravili sintetična IN vrata, ki integrirajo informacijo iz dveh vhodnih promotorjev (vhodni signal) in aktivirajo izhodni promotor (izhodni signal), le ko sta oba vhodna promoterja transkripcijsko aktivna. Integracija poteče preko interakcije med mRNA in tRNA. Sistem je modularen, ker so vhodni in izhodni signali promotorji. S spremembo vhodnih promotorjev lahko sistem vežemo na različne vhodne signale, medtem ko sprememba izhodnega promotorja lahko povzroči drugačen celični odziv.
Rezultati
In vrata z dvemi vhodnimi signali aktivirajo izhodni signal, le ko sta oba vhodna promotorja aktivna (ON). Idealno je, da je sistem modularen, kar pomeni, da lahko vhodne in izhodne signale z lahkoto zamenjamo. V transkripcijskih sistemih je prikladno, da so povezave med signali promotorji. Izhodni promotor lahko aktivira izražanje gena, ki proizvede določen celični fenotip ali pa deluje kot vhodni promotor v naslednja IN vrata.
V študiji so pripravili tri različne sisteme IN vrat in tako dokazali modularnost.
V prvem primeru so pripravili IN vrata z vhodnimi signali arabinoza in salicilat. Z aktivacijo ustreznih vhodnih promotorjev (Pbad in Psal) pride do aktivacije izhodnega promotorja Pt7 in izražanja proteina GFP. Tako dobimo fluorescenčne celice le ob prisotnosti dveh vhodnih signalov v okolju. Mehanizem IN vrat deluje preko interakcije različnih RNA molekul. Aktiviran Pbad zažene transkripcijo gena za polimerazo T7, ki pa ima dva vmesna amber stop kodona. Taka mRNA je translacijsko neaktivna. Aktivira jo gen supD, ki ga aktivira Psal. SupD je gen za tRNA, ki utiša amber (TAG) stop kodon in ga prekodira v kodon za serin. Na tak način le ob prisotnosti obeh vhodnih signalov v okolju pride do uspešne translacije polimeraze T7, ki aktivira izražanje GFP.
V drugem primeru so inpute zamenjali za dva naravna promoterja (quorum sensing in odzivnost na Mg2+). Pbad in Psal so zamenjali s PmgrB, ki se aktivira ob pomanjkanju Mg2+ in Plux, ki se aktivira ob prisotnosti acilhomoserina, ki je signal za celično gostoto. Pomanjkanje Mg2+ v E. coli zaznava dvokompontentni sistem PhoPQ. Ob znižani zunajcelični koncentraciji iona membranska komponentna PhoPQ fosforilira znotrajcelični regulator PhoPQ, ki aktivira PmgrB. Zaznavanje celične gostote (quorum sensing) je način komunikacije med bakterijami. Ta sistem je zelo pogosto uporabljen v sintetičnih genskih sistemih za programiranje celic, da tvorijo vzorce, regulirajo celično gostoto in ubijejo maligne celice kot odziv velike gostote. Lux promotor in luxR gen, iz V. fischeri, se inducira v odziv na eksogeni acilhomoserinlakton (AHS/AI-1).
V tretjem primeru so kot vhodna promotorja izbrali Psal in PmgrB (salicilat in Mg2+) in zamenjali izhodni signal GFP za Invazin. Tako aktivacija IN vrat omogoča invazijo bakterijskih celic. S tem poskusom so preverili ali lahko output IN vrat kontrolira celično obnašanje (invazivnost). Izražanje gena za invazin iz Y. pseudotuberculosis v E. coli omogoči invazijo sesalskih celic, ki imajo na površju B1-integrinski receptor. Sposobnost invazije so nato testirali, tako da so gojili bakterijske celice skupaj s sesalskimi.
Test invazije
Čeprav se izogibam opisovanju metod, naj vam opišem, kako so testirali intracelularno invazijo bakterij v sesalske celice. Obe vrsti celic so skupaj inkubirali v mikrotitrskih ploščah 1 uro. Nato welle sprali z medijem in antibiotikom, ter se tako znebili bakterij, ki niso invazirale. Sesalske celice so nato lizirali in lizate nagojili na LB plošče, kjer so zrastle bakterijske kolonije. Rezultate so primerjali s pozitivno kontrolo, kjer so bile bakterije ki so imele vstavljen gen za invazin pod kontrolo konstitutivnega promotorja.
Novejše študije
B. Wang et al (2011) so pripravili IN vrata, ki ne vsebujejo mehanizma nepopolne mRNA polimeraze T7, ampak gene hrp. Iz med teh hrpR in hrpS kot koaktivatorja in hrpL promotor. HrpL je brez koaktivatorjev popolnoma neaktiven. V tej študiji so poleg modularnosti poudarili tudi ortogonalnost, saj so poskuse izvajali na sevih E. coli, ki niso vsebovali testiranih promotorjev. V prvem primeru so za vhodne promotorje uporabili Plac in Pbad za signala IPTG in arabinozo. Output je bil v vseh primerih GFP. V drugem primeru so pa promotor Plac zamenjali za Plux. Uporaba ortogonalnih elementov je pomembna za kompatibilnost in načrtovanje večjih genskih vezij. Novo dodani deli in moduli naj se ne bi povezovali z že prisotnimi v organizmu. Prav tako ni zaželjena interakcija med sintetičnimi vnešenimi elementi ali teh z gostiteljevo šasijo. V tej študiji so tudi razvili teste za kompatibilnost sintetičnega vezja s šasijo. Ugotovili so, da na tak način minimizirajo neželjene interakcije.
Diskusija
V prvotni študiji so pripravili modularna IN vrata, ki bazirajo na utišanem genu za RNA polimerazo T7. Le ko sta oba vhodna promotorja aktivna, pride do popolne translacije. Ker so inputi in outputi transkripcijski signali, jih lahko zlahka zamenjamo. To modularnost so pokazali z več različnimi vhodnimi promotorji, ki so obdržali ustrezno obnašanje IN logičnih vrat.
Aktivnost IN vrat so v obeh študijah analizirali s prenosnimi funkcijami, ki nam povejo, kako je sprememba outputa občutljiva na spremembo posameznega inputa.
Končni cilj v oblikovanju genskih vezij je vkorporirati le-te v vedno bolj kompleksne sisteme. Z razliko od elektronskih vezij, kjer je tok informacije pogojen z žicami, moramo pri intracelularnih sistemih paziti na kontaminacijo v primeru neortogonalnih interakcij sintetičnih delov z gostiteljevo šasijo, kar lahko vodi do težav pri razvoju organizma in popačene rezultate študij. Velik minus prvotne študije je uporabljen gen za T7 polimerazo, ki ga ne moremo več uporabiti v istem sistemu za druge namene. Design tega sistema pa dovoljuje da se T7 zlahka zamenja s katerimkoli drugim transkripcijskim aktivatorjem.
Viri
- Anderson, J.C., Voight, C.A., Arkin, A.P. Environmental signal integration by a modular AND gate
- Wang, B, Kitney, R.I., Joly, N, Buck M. Engineering modular and orthogonal genetic logic gates for robust digital-like synthetic biology
