Izboljšanje tolerance na mraz in slanost
Prekomerno ektopično izražanje gena (SsCBF1) za povečano odpornost rastline proti stresnim dejavnikom
Uvod
Rastline so sesilni organizmi, v primeru neugodnih okoljskih razmer nimajo možnosti premestitve na bolj primeren kraj. Prilagodijo se lahko le s povečano ali zmanjšano sintezo biološko aktivnih molekul. Namen avtorjev članka je bil potrditev domneve, da dobi zelišče Arabidopsis thaliana odpornost proti mrazu oziroma suši ob prekomernem izražanju specifične skupine genov iz rastline Solanum lycopersicoides. Ključno vlogo pri tem igrajo proteini CBF/DREB (C-repeat (CRT)/dehydration-responsive element (DRE) binding factor (CBF/DREB1), ki se obnašajo kot transkripcijski faktorji. Ti se vežejo preko domene AP2 na C-ponavljajoče cis-delujoče elemente v promotorjih genov, udeleženih pri odgovoru na stres. V kmetijstvu bi lahko gensko spremenjene kulturne rastline odporne na mraz in sušo imele zelo pomembno vlogo pri zagotavljanju varnosti preskrbe hrane za človeštvo.
Metode
Avtorji v članku se nanašajo na ugotovitve prejšnjih raziskav, uporabljene metode in biološki materiali so bili predhodno validirani. Njihov namen je bila potrditev domneve, da pridobi zelišče Arabidopsis odpornost proti mrazu ob prekomernem izražanju transkipcijskega faktorja iz skupine CBF/DREB1.
Izolacija gena in analiza ugotovljenega aminokislinskega zaporedja Za potrditev prisotnosti vnešenega konstrukta 35spro:SsCBF1 so uporabili metodo RACE(rapid amplification of cDNA ends), z degeneriranimi primerji, ki pomnožujejo le SsCBF1 mRNA. Za specifičnost so nespremenjeno mRNA razgradili s tremi restrikcijskimi encimi BamH I, Hind III in Xba I, prepoznavna mesta katerih niso bila prisotna v mutiranem zaporedju SsCBF1.
Lokalizacija SsCBF1 v celici Nahajanje SsCBF1 v celici so ugotavljali s fluorescenčno konfokalno mikroskopijo z uporabo fuzijskega proteina SsCBF1-eGFP.
Priprava transaktivacijskih konstruktov Za ugotovitev razlike v izražanju SsCBF1 so transformirali liste rastline Nicotina benthamiana z infiltracijo Agrobacterium.
Aktivna in DNA-vezavna domena SsCBF1 Za potrditev aktivacijskega mesta na C-koncu aminokislinskega zaporedja SsCBF1 in domene preko katere se le-ta veže na pravo mesto DNA so uporabili dvohibridni sistem kvasovk.
Kvantitativna RT-PCR analiza PCR z reverzno transkriptazo so uporabili za ugotovitev nivoja izražanja SsCBF1 pri vseh preiskovanih rastlinah Solanum lycopersicoides, Nicotina benthamiana in Arabidopsis thaliana.
Transformacija arabidopsisa in fenotipska analiza Arabidopsis so transformirali z metodo 'floral dip' z uporabo seva Agrobacterium s konstruktom 35spro:SsCBF1. Fenotipske lastnosti so bile ovrednotene s fotografiranjem, primerjava med divjega in mutiranega tipa Arabidopsis thaliana (Col-0 in T3). Odpornost na mraz so ugotavljali s primerjavo rasti v klimatski komori. Odpornost na kaljenje semen so ugotavljali s pojavitvijo kalčka na agarju z in brez NaCl. Določanje odpornosti rasti korenin so naredili z meritvijo dolžine korenin.
Rezultati
Odpornost na mraz Primerjava vzdržjivosti med Solanum lycopersicoides in kulturnim paradižnikom je bila narejena tako, da so postavili 4 tedne stare rastline v komoro na 4°C za 8 ur in gledali uvenjenost listov. Listi paradižnika so bili uveli, listi Solanum lycopersicoides so bili normalni.
Izolacija in sekvenčna analiza SsCBF1 Ugotovitev ujemanja domen med SsCBF1 in ostalimi CBF1 proteini s Clustalx2.0 in DNAMAN. V Solanum lycopersicoides je bila stopnja ujemanja med ssCBF1 in ostalimi CBF proteini visoka. Solanum lycopersicoides CBF so se ujemali z Arabidopsis thaliana CBF1 le dveh zelo ozkih domenah.
Tarča SsCBF je DNA v jedru Meritev fluorescence s konfokalno lasersko mikroskopijo. Fuzijski protein SsCBF1-eGFP se je nahajal le v jedru, medtem ko se je prost eGFP nahajal tako v jedru kot v citosolu.
Aktivnost SsCBF1 v nivoju izražanja ob stresnih pogojih Vpliv na uravnavanje izražanja so določali s fluorescenco eGFP, glede na različna promotorja in vpliva transkripcijskega faktorja ssCBF1. Razlika med ekspresijo 35spro:eGFP in COR15A:eGFP bi morala biti različna glede na temperaturo rasti. Stopnja fluorescence je bila višja pri promotorju COR15A kjer se je izražal zraven še SsCBF1. Dodatno so ugotavljali še specifičnost vezavnega mesta SsCBF1 na cis-elemente CRT/DRE domene promotorja. Fluorescence ni bilo kjer so bila ta zaporedja izbrisana.
Natančnejša določitev domen SsCBF1 Z Y2H in uporabo restrikcijskih encimov so določili da je transkripicjska aktivnost omejena na del aminokislinskega zaporedja SsCBF1193-228. Obenem so zamenjali triptofan (W) v motivu LWNYS z alaninom in opazili so zmanjšano ekspresijo SsCBF1.
Nivo izražanja SsCBF1 v stresnih pogojih Z uporabo qRT-PCR so ugotavljali nivo izražanja SsCBF1 pod različnimi stresnimi pogoji. V vsakem primeru posebej (mraza, suše in hipertoničnosti) je nivo SsCBF1 narastel in nato padel, razlika je bila v časovnem intervalu in stopnji izražanja.
Odpornost SsCBF1 Primerjava rasti Arabidopsisa z navadnim promotrojem in promotorjem CaMV35S, ki ima zelo močno aktivnost. 7 dni stare rastline so bile zamrznjene, nato odmrznjene in nato postavljene v originalni medij. Rastline z močnješim reportjem za SsCBF1 so imele višji delež preživetja. Rastline s tem promotorjem so bile fenotipsko tudi nižje rasti v primerjavi z Col-0. Vpliv je tudi na odporonost proti slanosti, vendar ni bilo tako velike razlike. Dodatno so z qRT-PCR določali nivo izražanja različnih markerjev (COR15A, RD29A, KIN2 and AtCBF1) glede na normalne pogoje, mraz in slanost med Arabidopsis thaliana Col-0 in T3.
Zaključek
Avtorji so potrdili funkcijo SsCBF1 kot transkripcijski faktor, ki vpliva na odpornost Arabidopsis thaliana proti stresnim dejavnikom. Poleg tega so potrdili, da je aktivno mesto SsCBF1 LWNYS in ključno vlogo tripotfana v tem motivu ter prepoznavno domeno DNA, ki je C-ponavljajoče zaporedje.
