Kolorimetrični sistem za zaznavanje virusov na podlagi G - kvadrupleksov

Projekt kolorimetrični sistem za zaznavanje virusov na podlagi G-kvadrupleksov je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 in je bil nagrajen s prvim mestom v kategoriji najboljši diagnostični projekt. Sistem je zasnovala skupina NEFU China, ki je želela izboljšati dostopnost zanesljivega diagnosticiranja nalezljivih bolezni širši javnosti [1]. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: NEFU China.

Uvod

Skozi zgodovino so nalezljive bolezni predstavljale resno nevarnost človeštvu in povzročile mnogo smrti [1]. Do danes je bilo po svetu potrjenih več kot 500 milijonov primerov COVID-19 [2]. Virus povzroča mnogo problemov na globalni ravni in močno vpliva na življenje večine ljudi, prav tako pa ogroža globalno ekonomijo. Trenutne metode detekcije virusa, kot so RT-PCR, diagnosticiranje protiteles in antigensko testiranje, imajo določene omejitve. Predvsem so dolgotrajne, zahtevajo veliko količino vzorca, primerno opremo in izobražen kader. Te omejitve lahko predstavljajo problem pri zagotavljanju zadostne in natančne diagnoze bolezni. Pri svojem delu se je skupina osredotočila na manj razvite regije in države po svetu. Tam po navadi nimajo niti dobrega dostopa do laboratorijske opreme, ki je potrebna pri standardnih metodah testiranja, niti ne morejo vložiti veliko sredstev v nabavo materialov, da bi lahko zagotovili zanesljivo diagnosticiranje [1].

Skupina NEFU China je želela ne le skrajšati čas v katerem zaznamo virus, ampak tudi ustvariti platformo, ki bi jo lahko hitro prilagodili za testiranje novih patogenov. Njihovo idejo jim je uspelo izpeljati, saj so zasnovali sistem, v katerem lahko s spreminjanjem nekaterih komponent sistem hitro prilagodijo novim patogenom. Prav tako pa njihov sistem zagotavlja dobro občutljivost in specifičnost [1].

Načrt

Zamislili so si sistem, pri katerem bi selektivno pomnožili virus z rekombinazno-polimerazno pomnoževalno tehniko (RPA). Nato bi v verige uvedli zareze in uporabili polimerazo z visoko aktivnostjo izpodriva verige. Izpodrinjena veriga bi služila kot oligonukleotid za pomnoževanje vektorja po principu kotalečega se kroga. S pomnoževanjem vektorja bi proizvedli veliko količino G-kvadrupleksov, peroksidazna aktivnost le teh, pa bi omogočala detekcijo. Peroksidazna aktivnost bi namreč omogočila reakcijo s kromogenim substratom, s katerim bi vizualizirali pozitivne rezultate testa. Vse navedene reakcije je možno izvajati pri sobni temperaturi z minimalno laboratorijsko opremo, kar pomeni, da je zasnovana metoda zelo uporabna [1].

Zaradi biološke varnosti pri svojem projektu skupina NEFU China ni mogla uporabiti infektivnih virusov, kot je SARS-CoV-2 in njihovih nukleotidnih zaporedij. Kot virus, za katerega so zasnovali metodo, so si izbrali fag M13. Odločili so se, da bodo detektirali gen III [1].

Rekombinazno-polimerazno pomnoževanje–RPA (Recombinase polymerase amplification)

Metoda RPA omogoča pomnoževanje DNA pri konstantni temperaturi. Vsebuje tri ključne komponente: rekombinazo, protein SSB (single stranded binding protein), ki se veže na ssDNA (single stranded DNA), in DNA polimerazo. Rekombinaza se veže na začetni oligonuklotid in išče mesto, ki je komplementarno oligonukleotidu. Ko se začetni oligonukleotid veže na komplementarno mesto, se na matrici tvori D zanka, na enoverižno DNA pa se veže SSB. Nato rekombinaza oddisociira in DNA polimeraza sintetizira komplementarno verigo. Študentje so sami načrtovali specifične začetne oligonukleotide za gen III faga M13 [1].

S pomnoževanjem različno razredčenih vzorcev so ugotovili, da lahko z metodo RPA uspešno pomnožijo 1 kopijo DNA/μl. Želeli so tudi ugotoviti, katera temperatura je optimalna, zato so naredili eksperimente pri 25, 31 in 37 °C. Ugotovili so, da je reakcija najbolj učinkovita pri 31 °C [1].

Tarčno zarezovanje

Za ustvarjanje zarez so preizkusili različne strategije, zgledovali so se po metodah, ki se uporabljajo za urejanje genoma. Odločili so se, da bodo hkrati zasnovali specifične cinkove prste (ZF) in sistem CRISPR/CAS9, ki so ju nato preizkusili in izbrali bolj optimalno tehniko [1].

Želeli so ustvariti zarezo le na eni verigi, zato so ustvarili mutanto Cas9 (nCas9) proteina, ki je cepila le eno verigo. Pri ZF so izbrali restrikcijsko endonukleazo BbvCI iz bakterije Bacillus bevis, ki prepozna nepalindromno zaporedje CC^TCAGC/GC^TGAGG (^ nakazuje mesto cepitve). BbvCI je sestavljena iz dveh različnih podenot R1 in R2. Podenota R1 reže spodnjo verigo, medtem ko podenota R2 reže zgornjo verigo. V svojem projektu so uporabili R1+R2- mutanto, ki je poimenovana Nb.BbvCI [1, 3].

Najprej so želeli izraziti fuzijski protein Phi29-linker-nCas9 v E. coli. Zaradi velike molekulske mase niso mogli uspešno izraziti fuzijskega proteina, čeprav so večkrat optimizirali pogoje. Nato so se odločili, da bodo izrazili dva proteina Phi29-SH3 in nCas9-slig, ki sta interagirala preko dveh kratkih peptidov SH3 in slig. Nato so z EMSO (electrophoretic mobility shift assay) preverili, ali je nCas9 učinkovitejši od ZF-Nb.BbvCI pri ustvarjanju zareze v eni verigi. Izkazalo se je, da je ZF-Nb.BbvCI učinkovitejši, zato so se odločili za uporabo tega encima [1].

Izpodriv verige DNA

Za izpodriv verige so izbrali DNA polimerazo Phi29, ki se pogosto uporablja tudi za pomnoževanje po principu kotalečega se kroga. DNA polimeraza Phi29 ima 5'-3' polimerazno aktivnost in aktivnost izpodrivanja verige. Phi29 dodaja nukleotide za zarezo in pri tem izpodriva verigo. Nastala kratka ssDNA nato služi kot začetni oligonukleotid pri pomnoževanju po principu kotalečega se kroga [1, 4].

Kasneje so odkrili, da ima Phi29 3'-5' eksonukleazno aktivnost, ki bi lahko povzročila razgradnjo ssDNA oligonukleotida in tako ne bi dobili pravih rezultatov, zato so se odločili, da bodo preizkusili tudi Klenow fragment DNA polimeraze I, prav tako pa so naredili še Klenow fragment z mutacijo D424A (klenow.mut), ki ni imel 3'-5' eksonukleazne aktivnosti [1, 5].

Pomnoževanje DNA po principu kotalečega se kroga (Rolling circle amplification: RCA)

Izpodrinjena ssDNA se veže na komplementarno linearno matrico, ki vsebuje tandemske ponovitve G trakov. Matrica se ciklizira s pomočjo DNA ligaze T4. Po podvojevanju ssDNA matrice po principu kotalečega se kroga dobimo dolge veriga ssDNA, ki so sestavljene iz tandemskih ponovitev G traktov, ki lahko tvorijo G-kvadruplekse [1].

Najprej so zasnovali linearne matrice, ki bi jih ciklizirali s posebnim oligonukleotidom (lock probe), ki bi se vezal na oba konca matrice, in DNA ligazo T4. Nato bi uporabili drugi začetni oligonukleotid za pomnoževanje po principu kotalečega se kroga, vendar se je izkazalo, da eksonukleazna aktivnost polimeraze ni popolnoma razgradila oligonukleotida (lock probe), kar je vodilo v lažne pozitivne rezultate. Odločili so se, da bodo uporabili enak začetni oligonukleotid za ciklizacijo matrice in pomnoževanje po principu kotalečega se kroga. V tem sistemu se negativne kontrole niso obarvale, torej ni prišlo do lažno pozitivnih rezultatov [1].

Učinkovitost polimeraze Phi29, Klenowega fragmenta DNA polimeraze in Klenow.mut so preverjali na dva načina, saj jih je zanimalo, ali imajo vsi encimi aktivnost izpodriva verige in kateri bolje izvaja podvojevanje po principu kotalečega se kroga. Izkazalo se je, da imajo vsi trije encimi dobro aktivnost izpodriva verige. Ko so preverjali učinkovitost podvojevanja po principu kotalečega se kroga, se je kot najbolj učinkovit encim izkazala polimeraza Phi29, medtem ko pri Klenowem fragmentu in Klenow.mut niso zaznali aktivnosti. Tako so se odločili, da bodo v svojem detekcijskem sistemu uporabili polimerazo Phi29 [1].

Vizualizacija G-kvadrupleksov

G-kvadrupleksi so stabilne sekundarne strukture, ki jih tvorijo enoverižne DNA molekule. G-kvadrupleksi se lahko povežejo s kofaktorjem heminom, kar omogoči peroksidazno aktivnost G- kvadrupleksa. Tako G-kvadrupleks postane DNA encim (DNAzyme). Izbrali so si zaporedje G-kvadrupleks, ki so ga opisali Connelly in sodelavci. Kot substrat so si izbrali ABTS (2,2'-azinobis-3-etilbenzotiazolin-6-sulfonat). V prisotnosti vodikovega peroksida se ABTS^2- oksidira v zeleno obarvan radikal anion ABTS·-. Sprememba barve je vidna s prostim očesom, bolj natančno pa jo lahko kvantificiramo s spektrofotometrom pri valovni dolžini 420 nm [1, 6, 7].

Integrirano delovanje celotnega sistema

Potem ko so preverili delovanje vsake posamezne komponente ločeno, so preverili še delovanje celotnega sistema skupaj. Tako so najprej skupaj inkubirali proteina BbvCI-R1-ZF in Nb.BbvCI-R2-Phi29 ter dsDNA, ki je vsebovala prepoznavno mesto za BbvCI. Nato so mešanici dodali dNTPje in inkubirali 1 uro, v tem koraku je prišlo do sinteze ssDNA. Nato so izvedli pomnoževanje po principu kotalečega se kroga, reakcijo so izvajali 90 min. Nato so dodali hemin, ABTS in vodikov peroksid. Imeli so še ustrezne pozitivne in negativne kontrole, s katerimi so ovrednotili delovanje celotnega sistema kot uspešno [1].

Končni produkt

Končni produkt tako vsebuje rekacijsko mikrocentrifugirko A in B, dno, pokrov in zaščitni ovitek. Mikrocentrifugirka A je namenjena zbiranju vzorca, ki ga nato prenesemo v mikrocentrifugirko B. V mikrocentrifugirki B so tri enote za shranjevanje reagentov. Uporabnik zlahka dodaja reagente v ustreznem vrstnem redu in izvede detekcijo virusa. Vzorec bi pridobili iz sline, saj je občutljivost zasnovane metode dovolj velika, da bi lahko uspešno zaznali virus. Vzorce sline je potrebno obdelati s proteazo K, ki razgradi virusne kapside. Za aktivacijo proteaze K bi vzorce segrevali na 95 °C, kar bi dosegli s poliimidnim filmom, ki je poceni in omogoča temperaturni razpon med 30 °C in 130 °C. Nukleinska kislina bi bila po razgrajevanju virusne kapside dostopna za detekcijo. Tako zasnovan sistem bi omogočal enostavno in poceni diagnosticiranje, ki bi lahko bilo dostopno povsod po svetu [1].

Viri

[1] »Team:NEFU_China – 2021.igen.org« [Online]. Avalible: https://2021.igem.org/Team:NEFU_China. [Accessed 17-Apr-2022].

[2] »WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard« [Online]. Avalible: https://covid19.who.int/. [Accessed 17-Apr-2022].

[3] Heiter, Daniel F et al. “Site-specific DNA-nicking mutants of the heterodimeric restriction endonuclease R.BbvCI.” Journal of molecular biology vol. 348,3 (2005): 631-40. doi:10.1016/j.jmb.2005.02.034.

[4] Johne, Reimar et al. “Rolling-circle amplification of viral DNA genomes using phi29 polymerase.” Trends in microbiology vol. 17,5 (2009): 205-11. doi:10.1016/j.tim.2009.02.004.

[5] Pinky, Kukreti, Kamalendra, et al. Identification of a new motif required for the 3'-5' exonuclease activity of Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment): the RRRY motif is necessary for the binding of single-stranded DNA substrate and the template strand of the mismatched duplex.[J]. Journal of Biological Chemistry, 2008.

[6] R. Connelly, C. Verduzco, et al., Toward a rational approach to design split G-quadruplex probes, ACS Chem. Bio, 10:1021, 2019.

[7] Jiang, Hong-Xin et al. “G-quadruplex fluorescent probe-mediated real-time rolling circle amplification strategy for highly sensitive microRNA detection.” Analytica chimica acta vol. 943 (2016): 114-122. doi:10.1016/j.aca.2016.09.019.