Kombinatorična biosinteza terpenoidov v kvasovkah

Izhodiščni članek: Kombinatorična biosinteza terpenoidov v kvasovkah

Uvod

Terpenoidi so največji razred naravnih spojin, ki se uporabljajo kot zdravila. Tak primer predstavljata Taxol^® (Paklitaksel), ki spada med zdravila za zdravljenje raka in antimalarik artemizinin [1]. Podskupina terpenoidov so diterpenoidi, ki vsebujejo 20 ogljikovih atomov (C₂₀) in so sestavljeni iz štirih izoprenskih enot ter se pojavljajo v rastlinah, insektih, bakterijah in glivah [1, 2]. Obstajalo naj bi več kot 18.000 znanih diterpenov, ki izhajajo iz 126 različnih ogrodij. V naravi se po navadi nahajajo v zelo nizkih koncentracijah, zato potencial vseh obsotoječih diterpenov še ni raziskan. Njihova kompleksna struktura povzroča težave pri kemijski sintezi, saj je potrebno uporabiti veliko število kompleksnih korakov, ki pa imajo na koncu nizke izkoristke. Pred kratkim so pojasnili biosintezne poti diterpenoidov, zato so se usmerili v uporabo biološkega inženirstva, s katerim bi nadomestili kompleksne korake kemijske sinteze diterpenoidov [1].

Biosinteza diterpenoidov

Geranilgeranil disfosfat (GGPP) služi kot splošni prekurzor v biosintezi diterpenoidov. Na začetku diterpen sintaza (diTPS) pretvori GGPP v raznolika diterpenska ogrodja. Obstajata 2 glavna razreda diterpen sintaz. Razred II začne ciklizacijo molekule s protoniranjem dvojne vezi med C₁₄ in C₁₅ v GGPP. Pri tem nastanejo biciklični diterpenil-difosfati. Diterpen sintaze razreda I cepijo difosfatno estersko vez GGPP ali diterpenil-difosfata, ki ga sintetizirajo diTPS razreda II. V tem primeru nastane karbokation, ki začne reakcijo ciklizacije. Obstajajo tudi diterpen sintaze, ki so sposobne izvajati reakcije razreda I in II. Končni produkti diTPS so enojni ali večkratni diterpenski olefini ali alkoholi, ki imajo makrociklično ali policiklično strukturo [1].

Po pripravi diterpenskega ogrodja igrajo pomembno vlogo citokrom P450 oksigenaze (CYP), saj z uvajanjem skupin, ki vsebujejo kisik, preuredijo ogrodje terpenov in s tem povečajo raznolikost diterpenoidov. Pri CYP je zanimivo, da ne izvajajo reakcij le na naravnih substratih, vendar tudi na molekulah, ki imajo podobno strukturo kot njihovi naravni substrati. Kombinacija različnih diTPS in CYP omogoča pripravo že znanih ali naravi novih (angl. new-to-Nature) spojin [1].

Namen raziskave

Njihov namen je bilo kombiniranje CYP, ki delujejo na sorodna diterpenska ogrodja, vendar z oksidacijo na različnih mestih. Kombinacija CYP z ne naravnimi substrati bi tako omogočila pripravo novih diterpenoidov. Ker v naravi obstaja več kot 50 diTPS in 80 CYP, so se odločili, da bodo uporabili tri ogrodja, ki izhajajo iz (+)-kopalil difosfata ((+)-CPP) in uporabili CYP za katere je že znano, da katalizirajo reakcijo oksidacije na enem ali več izbranih ogrodij [1].

Rezultati in razprava

Strategija projekta

Pred začetkom raziskave so se zaradi velikega števila različnih diTPS in CYP odločili omejiti eksperimente na manjše število kombinacij. Izbrali so 10 encimov diTPS, ki sintetizirajo ogrodja iz (+)-CPP ter 4 CYP iz različnih rastlinskih vrst. Izražanje vseh izbranih kombinacij so izvedli v sevu INVSc1 Saccharomyces cerevisiae z uporabo vektorja pYES2. Vse kombinacije encimov so rezultirale v sintezi več kot 200 različnih diterpenoidov. Pridobljene produkte so izolirali in jih analizirali z GC-MS, LC-MS in NMR. S pomočjo spektrov MS ter NMR so določili 36 že znanih diterpenoidov, medtem ko 162 molekul niso našli v literaturi niti v knjižnicah spojin, zato so jih uvrstili v kategorijo naravi novih spojin [1]. Po prvi reakciji diTPS s substrati so nastali poleg že znanih ogrodij, še taka, ki spadajo med olefine (diterpenoidi, ki vsebujejo še dvojne vezi med ogljikovimi atomi) ter diterpenoidne alkohole (vsebujejo hidroksilno funkcionalno skupino) [1, 3].

Oksidacija diterpenov s CYP

V kvasovke so poleg genov za diTPS vstavili tudi 4 različne CYP. Uporabili so dva CYP iz dvokaličnic, rožmarina (Rosmarinus officinalis) in žajblja (Salvia pomifera) ter enega iz riža (Oryza sativa), ki spada med enokaličnice. Uporabili pa so tudi smreko sitko (Picea sitchensis), predstavnico golosemenk. Vsi od naštetih so kot substrat uporabili (+)-CPP. Na naravnih substratih skupaj oksidirajo mesta C₆, C₇, C₉, C₁₁, C₁₂ in C₁₈ v molekuli (+)-CPP. Pričakovali so, da bodo reakcije oksidacije potekale drugače na rahlo spremenjenih substratih, vendar bodo ostale regio- in stereospecifične. Ko so preverili vseh 10 diTPS s posameznimi CYP so dobili 110 oksidiranih diterpenoidov [1].

Ugotovili so, da večina kombinacij, ki so vsebovale CYP iz sitke, so sintetizirale naravi nove spojine. Te so v večini sintetizirale diterpenoide, ki so na C₁₈ vsebovale karboksilno skupino, kar je značilno tudi za endogene substrate sitke. Nato so izbrali 7 diTPS, ki so v kombinaciji s sitkinim CYP sintetizirali največjo količino diterpenoidov in so imeli karboksilno funkcionalno skupino na C₁₈. Sledilo je koizražanje z ostalimi encimi CYP. Na koncu so pridobili novih 87 nadalje oksidiranih diterpenoidov. Izvedli so še dodatne permutacije dveh ali treh CYP od nastalih diterpenoidskih kislin. Pri tem je nastalo le 10 naslednjih encimskih produktov. Še dodatna oksidacija teh molekul je privedla do 19 novih oksidiranih produktov. Ugotovili so tudi, da trans-biformen, nezukol in cis-abienol niso vstopili v reakcijo z vsemi CYP. Labda‑7,13E-dien-15-ol pa ni reagiral z nobenim od izbranih CYP. Novim produktom so strukturo določili s pomočjo NMR, medtem ko so nadaljne analize produktov izvajali predvsem z masno spektrometrijo in za že znane molekule niso določali strukture z NMR [1].

Oksidacija pimaranskega tipa diterpenov

Izopimaradien, ki spada med triciklične diterpene primaranskega tipa, je bil sintetiziran s strani IrKSL6 (diTPS iz Isodon rubescens), so s CYP iz sitke pretvorili v izopimarično-18-kislino. Poleg kislinskega produkta so s pomočjo GC-MS zaznali majhno količino intermediata izopimarične-18-kisline, izopimara-7,15-dien-18-ala. V primeru, ko so koizražali še CYP iz riža je to vodilo do nastanka glavnega produkta, ki so ga identificirali kot 6β,7α‑dihidroksi‑izopimara-8,15-dienojska kislina. Pri tej reakciji sta potrebni 2 stereospecifični hidroksilaciji kot tudi premik dvojne vezi (C₇ → C₈). V primeru, ko so namesto riževega CYP dodali žajbljevega, pa je nastala 2α-hidroksi-izopimarična kislina. IrTPS2, diTPS iz iste vrste, sintetizira nezukol, ki je v resnici hidroksiliran izopimaradien. Nezukol so nato s CYP iz riža pretvorili do nezukolne-18-kisline. Koizražanje CYP iz sitke in riža je vodilo v sintezo dveh glavnih produktov, ki so jih identificirali kot 6β,8β‑dihidroksi‑15‑izopimaren-18-ojska kislina in epoksi-8β,9-izopimarenojska kislina [1].

Regioselektivnost in določevanje strukture CYP

Iz pridobljenih podatkov so ugotovili, da vsi štirje testirani CYP ohranijo regioselektivnost, razen z izjemo spojine 26 oz. trans-biformen-3β-ola. Odkrili so tudi razliko v ohranitvi stereospecifičnosti 2α-hidroksi skupine, ko je bil CYP iz žajblja koizražen s CYP iz sitke. So pa vsi encimi pokazali raznolikost reakcij na različnih diterpenoidnih substratih. Iz teh poskusov so tako sintetizirali 4 spojine, ki so naravi nove, ostale pa so identificirali s pomočjo že znanih baz masnih spektrov [1].

Molekulska umestitev substrata na osnovi mehanizma

Opazili so, da je CYP iz sitke oksidiral trans-biformen na mestu C₃, namesto na mestu C₁₈. Da bi razumeli mehanizem regioselektivne oksidacije so izvedli računalniško simulacijo umestitve substrata. Najprej so z AlphaFold-om pripravili 3D strukturo CYP. Temu so nato dodali substrat trans-biformen in nezukol ter jih poskusili umestiti v aktivno mesto encima. Ugotovili so, da sta vodikova atoma trans-biformena na atomih C₁₈ in βC₃ v bližini kisiku iz hema. Tako obe poziciji izkazujeta enako reaktivnost. V primeru nezukola pa je vodikov atom na C₁₈ bližje kisiku hema kot pa βC₃, tako je verjetnost oksidacije večja na atomu C₁₃ [1].

Zaključek

Z izsledki te raziskave so ugotovili, da so kvasovke primeren organizem za kombinatorično biosintezo diterpenoidov. S pomočjo kvantitativnega NMR in uporabe standardnih raztopin že znanih produktov, so preko podatkov pridobljenih z LC/GC-MS izračunali izkoristke biosinteze. Kombinacija različnih encimskih oksidacij in kemijskih sintez je omogočila sintezo devetih visoko oksidiranih naravnih diterpenoidov. Z uporabo kombinatorične biosinteze v kvasovkah je sinteza različnih produktov neodvisna od razpoložljivosti specifičnih diterpenoidov. Vsi diterpenoidi imajo skupne strukturne lastnosti A-obroča, ker vsi izhajajo iz (+)-CPP, medtem ko so strukturne lastnosti B in C-obroča lahko različne. Z uporabo še več različnih CYP bo na voljo večje število produktov. To bo omogočilo pripravo knjižnic diterpenoidov, kar bo omogočilo presejalne teste za iskanje novih potencialnih antivirotikov ali protirakavih učinkovin. Poleg tega pa pa so pokazali, da je možno izvesti sintezo teh kombinacij v kvasovkah, kar bo omogočilo cenejšo pripravo večjih količin diterpenoiodov.

Literatura

[1] M. Frey, U. Bathe, L. Meink, G. U. Balcke, J. Schmidt, A. Frolov, A. Soboleva, A. Hassanin, M. D. Davari, O. Frank, idr.: Combinatorial biosynthesis in yeast leads to over 200 diterpenoids. Metab Eng 2024, 82, 193–200.
[2] S. Perveen, S. Perveen: Introductory Chapter: Terpenes and Terpenoids. Terpenes and Terpenoids 2018.
[3] J. Andersen-Ranberg, K. T. Kongstad, M. T. Nielsen, N. B. Jensen, I. Pateraki, S. S. Bach, B. Hamberger, P. Zerbe, D. Staerk, J. Bohlmann, idr.: Expanding the Landscape of Diterpene Structural Diversity through Stereochemically Controlled Combinatorial Biosynthesis. Angewandte Chemie International Edition 2016, 55, 2142–2146.