Li+on Switch

Projekt Li+on Switch - diagnostični sistem za samostojno merjenje koncentracije litija v sistemu

Skupina TU Braunschweig je v letu 2023 sodelovala na iGEM tekmovanju, kjer so prejeli nagrado za najboljši diagnostični projekt (Overgrad), se uvrstili med 10 najboljših overgradskih projektov ter bili nominirani za kategorijo Najboljši sestavljeni del (Overgrad) in osvojili zlato medaljo.

Več o njihovem projektu najdemo na naslednji povezavi: https://2023.igem.wiki/tu-braunschweig/description

Avtorica povzetka: Hana Glavnik

Uvod

Biopolarna motnja je ena izmed mentalnih bolezni, ki močno vpliva na življenje posameznika. Po podatkih Nemškega združenja za bipolarno motnjo (DBGS) je v Nemčiji 2,5 miljona ljudi, ki imajo diagnosticirano bipolarno motnjo. Zanjo so značilne epizode manije in depresije v izmenljivih se intervalih, te epizode pa močno vplivajo na bolnikovo vsakdanje življenje. Najboljša opcija nadzorovanja simptomov so trenutno litijeve spojine, ki delujejo kot stabilizatorji razpoloženja [1]. Že več kot 60 let se uporabljajo za zdravljenje bipolarne motnje. Z raziskavami je bilo ugotovljeno, da je litij učinkovit pri obvladovanju maničnih in depresivnih epizod in pomaga zmanjšati tveganje pojava samomorilnega vedenja. V telesu sodeluje pri signalizaciji, posredovani z nevrostransmiterji in receptorji, pri regulaciji hormonov, cirkadianega ritma ter prenosu ionov in izražanju genov. Povezujejo ga z aktivacijo nevrotrofičnih poti, ki so vključene v patofiziologijo bolezni [2].

Terapija z litijevimi spojinami povzroča kar nekaj neželenih stranskih učinkov. Vpliva lahko na prebavila, delovanje srca, ledvic in na kognitivne sposobnosti posameznika [3]. Poleg naštetih stranskih učinkov lahko pride tudi do zastrupitve z litijem. Raven litija, ki je potrebna za učinkovito terapijo in njegova citotoksična raven sta po podatkih zelo blizu, zato je predvsem pomembno, da se njegovo koncentracijo v telesu skrbno nadzoruje. Z začetkom terapije je nadzorovanje potrebno izvajati tedensko, zato morajo obstajati metode, ki natančno in zanesljivo merijo njegovo koncentracijo. Trenutno pa je to možno le preko laboratorijske analize krvi [1].

Cilji projekta

Cilj skupine je bilo zasnovanje sistema za testiranje ravni litija na domu z uporabo RNA-stikala, ki se odziva na koncentracije litijevih ionov. S takšnim sistemom bi si pacient lahko sam izmeril koncentracijo litija, s tem pa se izognil obiskom zdravnika in laboratorijskim analizam vzorcev krvi. Prav tako bi s tem lahko preprečili možnost zastrupitve z litijem [1].

Zasnova RNA-stikal

Za zasnovo učinkovitega in natančnega sistema za merjenje koncentracije litija so uporabili pred kratkim odkrito RNA-stikalo Li+II. Za natančno in zanesljivo merjenje koncentracije ionov je nujno, da lahko ta sistem zagotavlja zaznavo terapevtskih koncentracij litija (0,6 do 1,2 mM) in toksičnih koncentracij višjih od 1,5 mM [1]. RNA-stikalo je strukturna nekodirajoča domena RNA, ki jo uporabljajo številne bakterije za regulacijo koncentracij ciljnih ligandov in izražanja genov. Ponavadi se nahajajo v regiji na 5'-koncu mRNA, ki se ne prevaja (UTR), tam pa tvori aptamerno strukturno domeno, ki je sposobna vezave liganda [4]. Uporabljeno RNA-stikalo nhaAII spada v skupino translacijskih RNA-stikal in je velikokrat asociirano z geni nhaA v bakterijah. Po transkripciji se na ravni mRNA tvori sekundarna struktura, ki zakriva vezavno mesto za ribosom (RBS). Ob vezavi liganda v aptamerno strukturo stikala se razkrije RBS, kar omogoči nemoten potek translacije. Pri pripravi takšnega sistema so želeli preko RNA-stikala in signala ustreznega reporterskega proteina kvantitativno zaznati koncentracijo litija. Za čim bolj natančno kvantifikacijo koncentracij litija so preizkušali 4 reporterske proteine, in sicer LacZ/β-galaktozidaza, sfGFP, NanoLuc ter mScarlet-13. Vse skupaj so pripravili 20 različnih konstruktov ter preverjali njihovo delovanje, konstrukte pa so klonirali s pomočjo metode Golden Gate Assembly (GGA) [1].

Zasnova prvotnega konstrukta R1

Prvotni konstrukt (R1) je vseboval promotor T7, distančnik, RNA-stikalo nhaA-II, temu je sledilo zaporedje distančnika s predvidenim RBS, nato pa še zaporedje gena nhaA ter zaporedje reporterskega proteina. Promotor T7 so izbrali zaradi enega ključnega razloga, in sicer zaradi visoke translacijske učinkovitosti pri delovanju v kombinaciji s T7 RNA-polimerazo. Prav tako so poudarili pomen zgradbe konstrukta, saj so želeli ohraniti naravno okolje stikala, da bi se ta pravilno zvil in opravljal svojo funkcijo [1].

Zasnova ostalih konstruktov R2, R3, R4 in R5

Konstrukt R2 je bil zasnovan z razlogom, da bi preverili, kako odsotnost distančnika med promotorjem in RNA-stikalom vpliva na zvitje stikala in občutljivost na litijeve ione. S tem bi dobili konstrukt, ki bi ga uporabili, če bi bil konstrukt R1 preobčutljiv [1]. Konstrukt R3 je bil po svoji zgradbi enak prvotnemu, vendar so v zaporedju distančnika med RNA-stikalom in nhaA genom, predviden RBS nadomestili s Shine Dalgarnovim zaporedjem. Ta konstrukt bi jim pomagal pri povečanju občutljivost, saj bi izboljšali izražanje reporterskega gena [1]. Konstrukt R4 se je od R1 in R3 razlikoval le v tem, da je imel vstavljeno zaporedje g10T7 RBS, ki je bilo pridobljeno iz bakteriofaga T7. S to zamenjavo so želeli preveriti, če bi lahko izražanje reporterskega gena izboljšali z močnejšim vezavnim mestom za ribosom [1]. Konstrukt R5 je služil kot kontrola in je vseboval le promotor T7 in reporterski protein [1].

Rezultati

Kloniranje konstruktov in preverjanje uspešnosti

Uspešnost kloniranja so preverjali s pomočjo sekvenciranja, samo kloniranje pa so izvedli z metodo Golden Gate assembly (GGA). Po natančno izvedenih eksperimentih so odkrili, da so le pri konstruktu R1 ter kontrolnemu konstruktu R5 dobili zanesljive rezultate [1].

Ugotavljanje najboljših pogojev za rast bakterij

Na začetku so vse celične teste izvajali v mediju LB z nizko koncentracijo Na+ in pH 9. To vrednost so izbrali z razlogom, ker bakterije v bolj bazičnem okolju vnašajo večje koncentracije litijevih ionov. Vendar so hitro prišli do spoznanja, da je rast bakterij v takšnem okolju močno inhibirana. Za izvajanje nadaljnih eksperimentov pri optimalnih pogojih, so rast testirali v različnih medijih z različno vsebnostjo hranil in vrednostjo pH. Uporabili so konstrukt pozitivne kontrole, kjer je bil sfGFP pod kontrolo z raminozo inducibilnega promotorja T7. Iz rezultatov so ugotovili, da je bilo izražanje sfGFP v mediju LB z nizko koncentracijo Na+ največje, vendar je bila rast bakterij najpočasnejša. Tudi v mediju TB, ki je imelo najboljše razmerje hranil, je bila ekspresija sfGFP nepričakovano nizka. Iz tega so sklepali na negativen vpliv koncentracije soli v mediju na meritve. Pri visokih vrednostih pH je bila rast bakterij močno inhibirana, zato so se odločili uporabiti medij z nevtralno vrednostjo pH [1].

Identifikacija najbolj uspešnega konstrukta za testni sistem

Zaradi različnih kombinacij konstruktov so najprej vse testirali v celičnem okolju in nekaj kombinacij uspeli izločiti še preden bi eksperimente začeli izvajati v cenovno dražjih brezceličnih sistemih. Izražanje konstruktov so pri vseh eksperimentih inducirali z dodatkom raminoze. Pri testiranju konstruktov s sfGFP so identificirali le en najbolj primeren konstrukt, in sicer konstrukt 1G. Za razliko od konstruktov 2G, 3G, in 4G, se ta uspešno odziva na koncentracijo Li+ ionov s spreminjanjem konformacije (odprta ali zaprta). Prav tako so pozitivne rezultate dobili pri kontrolnem konstruktu 5G. Naknadno so pri kontruktu 1G preverili še odziv na različne koncentracije Li+ ionov in dokazali natančno in zanesljivo zaznavanje tako terapevtskih koncentracij kot razlikovanje med toksično in netoksično koncentracijo litija.

Konstrukte, ki so vsebovali reporter mScarlet-13 so izločili, saj konstrukt 1M ni razlikoval med različnimi koncentracijami Li+ ionov, najverjetneje zaradi nepravilnega zvitja RNA-stikala.

Vsi celični testi s konstrukti, ki so vsebovali LacZ so se izvajali v bakterijah E.coli KRX, pri teh pa so naleteli na kar nekaj težav. Težave so imeli že pri sami sintezi LacZ zaporedja, nato so pri testiranju z X-Gal dobili binarne rezultate, zato s tem substratom niso izvajali kvalitativnih meritev. Pri testu substrata ONPG so imeli težave s toksičnimi kemikalijami (β merkaptoetanol, kloroform), zato je bilo potrebno te izvajati v digestoriju. Med testiranjem z različnimi koncentracijami Li+ ionov pri OD420 so dobili precej slabše rezultate kot pričakovano, kar pa je na koncu vodilo v zavrnitev teh konstruktov.

Testiranja za reporter NanoLuc so izvajali v sevih E.coli KRX in BL21(D3), te kulture pa so različno redčili zaradi intenzitete signala, ki je odvisna tako od encima kot tudi od substrata (Furimazin). Najprej so razvoj in intenziteto signala merili le s kontrolo (konstrukt R5), da bi se izognili vplivom litijevih ionov. Za sev KRX so določili optimalno redčitev kulture 1:100, za BL21(D3) pa 1:1000. Nato so testirali še odziv stikala na prisotnost litija. Pri sevu BL21(D3) se je samo konstrukt 2N odzval s signifikantno višjo intenziteto signala, medtem ko se je pri sevu KRX najboljše odzval 1N konstrukt, rezultati za konstrukt 2N pa so bili tukaj slabši [1].

Testiranje sistema v brezceličnem okolju

Za izražanje proteinov v brezceličnem okolju so uporabili biotechrabbit RTS E. coli HY kit, s katerim so testirali le konstrukta 1G in 1N. Pridobljeni rezultati so pokazali uspešno zasnovo testnega sistema, saj so s konstruktoma uspešno detektirali litijeve ione. Pri konstruktu 1G niso testirali odziva na različne koncentracije Li+ ionov, vendar samo na prisotnost ali odsotnost ionov. Pri konstruktu N1 pa so izvedli test odziva na različne koncentracije litijevih ionov in ugotovili, da je izražanje proteina NanoLuc povišano ob prisotnosti litija. Tukaj signal pri višjih koncentracijah ni naraščal kot so pričakovali, temveč je upadal. Trdijo, da bi lahko bili rezultati nezanesljivi, saj eksperimenta niso ponovili, hkrati pa bi lahko bila problematična prehitra poraba substrata [1].

Cilji za prihodnost

Za izboljšanje njihovega testnega sistema LI+on Switch bi v prihodnosti potrebovali optimizirati konstrukte 1N in 1G za boljšo kvantifikacijo Li+. Prav tako bi bilo potrebno testirati odziv konstrukta 1G pri različnih koncentracijah litijevih ionov, pri konstruktu 1N pa izvesti več meritev [1].

Literatura

[1] Project Description | TU-Braunschweig - iGEM 2023 https://2023.igem.wiki/tu-braunschweig/description (accessed May 16, 2024).

[2] R. Machado-Vieira, H. K. Manji, C. A. Zarate: The role of lithium in the treatment of bipolar disorder: convergent evidence for neurotrophic effects as a unifying hypothesis. Bipolar Disord 2009, 11, 92.

[3] C. Volkmann, T. Bschor, S. Köhler: Lithium Treatment Over the Lifespan in Bipolar Disorders. Front Psychiatry 2020, 11.

[4] K. Kavita, R. R. Breaker: Discovering riboswitches: the past and the future. Trends Biochem Sci 2023, 48, 119.