Mehanizem metilacije DNA

Uvod

DNA metilacija je pomemben epigenetski marker, ki nadzoruje izražanje genov

Metilacija DNA je pravzorčni epigenetski marker. Prenaša se z genetskim materialom, ampak pri tem ne vpliva na zaporedje. Lahko regulira genomsko aktivnost in obstoji skozi cepitev, mitozo in mejozo.

DNA metilacija je ključna pri sesalcih; izguba vodi do ustavitve rasti ali apoptoze v normalnih celicah, kot tudi v rakavih. Prisotnost metilacije DNA je nujno potrebna za embriološki razvoj. Ključna vloga metilacije DNA je nadzorovati izražanje genov; tako so metilirana zaporedja represirana.

Metilacija DNA pri prokariontih

Do metilacije DNA pri prokariontih prihaja na nukleotidih adeninu in citozinu. Metilacijo katalizirata dva različna tipa encimov, metilaze in metiltransferaze. Za obe skupini encimov je donor metilnih skupin S-adenozil metionin (SAM; v nekaterih člankih AdoMet).

Metilaze

Med te spada DAM metilaza (DNA adenin metilaza), ki katalizira prenos metilne skupine s SAM na adenin. Prepoznava nukleotidno zaporedje 5'-GATC-3' in metilira adenin v tem zporedju. Specifično prepoznava na novo sintetizirano verigo DNA, ki še ni metilirana, in jo metilira. To, da je nova veriga za kratek čas nemetilirana, omogoča celici, da razlikuje med staro in novosintetizirano verigo. Celica lahko zato uporabi mismatch repair pot za popravilo morebitnih mutacij na DNA, ki so nastale pri replikaciji.

DAM metilaza sodeluje tudi pri regulaciji replikacije in regulaciji ekspresije proteinov (oboje je dobro raziskano na bakteriji E. coli). Del regulacije replikacije pri E. coli opravljata ATP in DnaA. Svojo vlogo pri tem pa igra tudi DAM metilaza. OriC pri E. coli vsebuje 11 ponovitev 5'-GATC-3', ki jih metilaza prepoznava. Takoj po replikaciji je oriC hemimetiliran in je odstranjen iz nadaljnjih interakcij tako, da je vezan na membranski protein. Šele ko se sprosti, ga DAM metilaza popolnoma metilira in tako omogoči vezavo DnaA, ki sproži replikacijo.

DAM metilaza lahko metilira tudi zaporedja vzdolž DNA, ne le na mestu oriC. Metilirana mesta spodbujajo transkripcijo.

Metiltransferaze

Drugi tip encimov so metiltransferaze. V naravi obstajata dva razreda prokariontskih metiltrasferaz. En razred metilira C-atome znotraj obročev in tako tvori C5-metilcitozin (M.HhaI). Drug razred metilira eksociklične dušike in tvori N4-metilcitozin (M.PvuII) ali N6-metiladenin (M.TaqI). Oba razreda uporabljata kot donor metilnih skupin SAM in vse metiltransferaze znotraj teh razredov delujejo kot monomeri.

Med prokariontskimi metiltransferazami je bilo največ raziskav opravljenih na M.HhaI. Med drugim je prav na tem encimu bil določen mehanizem delovanja metiltransferaz. M.HhaI je encim pridobljen iz bakterije Haemophilus haemolyticus. Ta encim na dvoverižni DNA prepozna zaporedje 5′-G(C)GC-3′ in metilira tisti citozin znotraj tega zaporedja, ki je v oklepaju.

Mehanizem reakcije metilacije

V reakciji sodelujejo metiltrasferaza, dvoverižna DNA in SAM. Najprej metilaza pripravi DNA na reakcijo. Pri tem tarčni citozin obrne tako, da sedaj štrli ven iz verige in je najbliže aktivnemu mestu. Ker mora biti cistein v aktivnem mestu, ki deluje kot nukleofil, pred napadom na mesto C6 citozina deprotoniran, potrebuje bazo, ki mu odvzame proton. Izkaže se, da kot baza deluje negativno nabita fosfatna skupina na DNA, ki se nahaja v bližini mesta metilacije. (Proton se nato najbrž prenese na molekule vode v okolici.) Tako DNA vbistvu igra vlogo substrata in kofaktorja. V naslednjem koraku deprotonirani cistein napade citozinski obroč na mestu 6 (Michaelova adicija) in tvori z njim kovalentno vez. V tem kovalentnem aduktu je aktiviran nukleofilni značaj mesta C5 citozina in lahko sedaj napade SAM. Pri tem se prenese metilna skupina na C5 citozina. Sledita še deprotonacija mesta C5 in eliminacija encimskega nukleofila (cisteina). Ko postane afiniteta metiltransferaze manjša, se metilcitozin zasuka nazaj navznoter v verigo DNA.

Metilacija DNA pri evkariontih

Vloga metilacije DNA

DNA metilacija igra ključno vlogo v nadzorovanju celičnih procesov, vključno z embrionalnim razvojem, transkripcijo, deaktivacijo X kromosomov in genomskim »imprintigom«. Pri ljudeh se metilacija zgodi na C5 poziciji citozinov, ki so pred gvaninom; te imenujemo dinukleotidni CpG. Približno 1% baz v človeškem genomu je metil-citozinov, kar nanese. V normalnih celicah se metilacija zgodi predvsem na ponavljajočih se genomskih regijah. CpG-ji niso naključno porazdeljeni v genomu; namesto tega so znane CpG bogate regije, imenovane kot CpG otočki, ki so na 5´̀ koncih mnogih človeških genov (56%). Večina (94%) CpG otočkov ostane ne metiliranih v normalnih celicah.

V splošnem je metilacija CpG otočkov je povezana z utišanjem genov. Dokazano je bilo, da metilirani otočki vežejo histonske deacetilaze in ostale faktorje, ki so vpleteni v transkripcijo in utišanje. Vendar se ta enostaven pogled zakomplicira z odkritjem, da vsaj eden CpG vezavni protein, MeCP2, lahko deluje kot transkripcijski aktivator v redkih primerih CpG metilacije. Po analogiji s CpG otočki, ki se nahajajo na tkivno specifičnih genih, jih mnogo ostane ne metiliranih v vseh stopnjah razvoja . Tako morajo biti v igri drugi mehanizmi, da so ti geni utišani. Majhen, a pomemben del CpG-jev se metilira med razvojem.

Genomski »imprinting« potrebuje tudi hipermetilacijo DNA na enem izmed dveh starševskih alelov gena, da zagotovi monoalelno ekspresijo.

Proteini pri metilaciji DNA pri evkariontih

Pri večceličnih evkariontih je metilacija, ki se pojavi takoj po replikaciji omejena na citozinske baze. Metilacija poteka z zamikom, tako da je omogočeno tudi njeno popravljanje. Poznana sta dva glavna načina poteka metiliranja.

Osnova obeh procesov je vezava metilne skupine na verigo DNA. Reakcijo katalizirajo DNA metiltransferaze (DNMTs), tako da s kovalentno adicijo na C6 preko Cys81 aktivira C5 atoma citozina za elektrofilni napad S-adenozil-L-metionina (AdoMet) in prenos metilne skupine na mesto 5 v citozinskem obroču. Po končani reakciji pride do odcepa encima in deprotonacije C5.

Ločimo tri vrste DNA metil transferaz glede na stopnjo metilacije, vse pa se med seboj ujemajo v 6 strukturnih motivih, od katerih se 5 nahaja v aktivnem mestu za AdoMet, kar nakazuje da se vsi delujejo po istem principu.

Prvi tip metilacije ti. maintaince metilacijo izvaja DNMT1. Izvede hemimetilacijo DNA, kar se sklada z njeno funkcijo vzdrževanja saj metilira le komplementarno verigo. Tako je zagotovljeno, da bo hčerinska veriga pravilno metilirana, položaj metil citozina v prepoznavnih zaporedjih transkrpcijskih faktorjev pa prepreči njihovo vezavo na verigo DNA.

DNMT3a in DNMT3b lahko metilirata popolnoma nove dele genoma po procesu de novo. Proces de novo metilacije je drugi tip inhibicije ekspresije genov, ki se prične z vezavo metil CpG vezavnih proteinov (MBD) na metilirane citozine v promotorski regiji. MBD kompleksi nato na promotorsko regijo vežejo histon, s pomočjo histon deacetilaze (HDAC) (npr. NurD kompleks) in histonmetiltransferaze (HMTaze), ter tako deaktivirajo kromatin na mestih kjer se nahajojo geni. Metilacija histonskih repov vpliva tudi na strukturo histonskega jedra. Pomembna je predvsem reakcija na Lys.

MBD proteini imajo klinasto strukturo sestavljeno iz ß ravnin, ki se nahajajo nad α vijačnico. Stranske verige aminokislin pri dveh ß ravninah, skupaj z N-koncem α heliksa interagirajo z metiliranimi citozini na glavni verigi DNA in tako zagotovijo strukturno osnovo za selektivno prepoznavanje CpG dinukleotidov.

Viri

Egor Prokhortchouk, Pierre-Antoine Defossez. The cell biology of DNA methylation in mammals, Biochimica et Biophysica Acta 1783 (2008) 2167–2173

Casadesús J, Low D. The great GATC: DNA methylation in E. coli. Microbiology and Molecular Biology Reviews 70 (September 2006) 830–856

Ronen Zangi, Ana Arrieta, Fernando P. Cossío. Mechanism of DNA Methylation: The Double Role of DNA as a Substrate and as a Cofactor. J. Mol. Biol. (2010) 400, 632–644

Fa-Kuen Shieh and Norbert O. Reich. AdoMet-dependent Methyl-transfer: Glu119 Is Essential for DNA C5-Cytosine Methyltransferase M.HhaI. J. Mol. Biol. (2007) 373, 1157–1168

Moshe Szyf. DNA methylation and demethylation probed by small molecules. Biochimica et Biophysica Acta 1799 (2010) 750–759