Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA

Uvod

Zorenje mRNA zajema več različnih kemijskih modifikacij in med drugim tudi dodajanje kape na 5’-koncu verige. Ta proces ima pomembno vlogo pri:

• povečevanju stabilnosti verige mRNA, saj jo kapa ščiti pred napadi eksonukleaz
• izvozu verige iz jedra, saj se nanjo lažje vežejo proteini, ki omogočajo transport
• izrezovanju 5’-introna
• pospeševanju translacije, saj spodbuja vezavo iniciacijskega faktorja (eIF4E).

Če molekuli mRNA omenjena struktura manjka, se bo razgradila v citosolu.

Proces dodajanja kape

Struktura kape na 5’-koncu mRNA nastane kotranskripcijsko in preide več encimskih reakcij. Najprej encim RNA-5’-trifosfataza (TPaza) z iniciacijskega nukleotida odstrani γ-fosfat. Nato se naslednji encim RNA gvanililtransferaza (GTaza) kovalentno poveže z α-fosfatom molekule GTP. Z GTP se sprosti molekula pirofosfata (PPi) in nastane intermediatni kompleks Encim-GMP. Ta kompleks omogoči prenos molekule GMP na prej omenjeni iniciacijski nukleotid. Produkt spojitve je struktura kape na 5’-koncu mRNA. Zatem sledi metilacija gvaninskega dela kape na mestu N7, kar omogoči encim (gvanin-N7)-metiltransferaza (N7-MTaza).

Opisani proces velja za tvorbo kape-0, ki pa se lahko še nadgradi z metilacijo na mestu 2'-O na riboznem delu nukleotida. Če se metilira mesto 2’-O na riboznem delu prvega nukleotida (tj. naslednji nukleotid od iniciacijskega), potem taki strukturi pravimo kapa-1. Če pa se metilirata mesti 2'-O na riboznem delu prvega in drugega nukleotida, taki strukturi pravimo kapa-2. Proces metilacije omogoči encim 2'-O-metiltransferaza (2'-O-MTaza). Tako encim 2'-O-MTaza kot N7-MTaza katalizirata prenos metilne skupine z metilnega donorja S-adenozil-L-metionina (SAM). Stranski produkt teh dveh kataliziranih reakcij je S-adenozil-L-homocistein (SAH).

Za koronavirusno mRNA se predvidevata dva možna mehanizma dodajanja kap. Prvi je konvencionalni mehanizem dodajanja kape-1, drugi pa je tak kot pri alfavirusih. Razlika med mehanizmom pri alfavirusih in konvencionalnim je le ta, da se GTP metilira na mestu N7 še preden se prenese na iniciacijski nukleotid, ki mu je bil γ-fosfat že odstranjen.

Kape pri RNA virusih

Virusi, ki okužijo evkariontske celice, so razvili različne strategije tvorbe kap lastnih molekul RNA. DNA virusi in retrovirusi se podvajajo v jedru in pri tvorjenju kape izkoristijo molekule gostiteljske celice. Številni virusi, ki pa se podvajajo v citoplazmi in nimajo dostopa do molekul, potrebnih za dodajanje kape, so v svoj genom vgradili zapise za lastne aparate dodajanja kap. Čeprav sta molekulska organizacija in biokemijski mehanizem tvorjenja kape v virusih različna, so si končne strukture kap podobne.

Negativno usmerjeni RNA virusi iz družin Bunyaviridae in Orthomyxoviridae so razvili edinstven cap-snatching mehanizem. Ta omogoča prevzem kap gostiteljskih molekul mRNA. Mehanizem deluje tako, da virusna od RNA odvisna RNA polimeraza (RdRp) preko podenote PB2 veže 5’-konec gostiteljske mRNA, ki že ima kapo. Virusna polimeraza RdRp pa ima tudi endonukleazno aktivnost, ki ji omogoči, da odcepi kratek del verige mRNA, na katerem je kapa. Odcepljen košček verige deluje kot primer (ang. primer) za virusno polimerazo RdRp. Tako lahko poteče transkripcija virusnega zapisa, kjer je matrična veriga negativna virusna RNA. RdRp sintetizira komplementarno negativno verigo mRNA.

Za virus vezikularnega stomatitisa (VSV) predvidevajo, da se monofosforiliran 5’-konec mRNA verige veže na GDP. Proces naj bi deloval tako, da GTPazna aktivnost v RdRp povzroči nastanek GDP iz GTP. Ta GDP ostane vezan v RdRp in bo deloval kot akceptor mRNA. Med transkripcijo nascentni transkript interagira z aktivnim mestom poliribonukleotidiltransferazne domene, ki se nahaja v RdRp. Posledica interakcije je odcep PPi in nastanek 5’-monofosforiliranega konca verige mRNA, ki se še vedno drži RdRp. Aktivnost poliribonukleotidiltransferazne domene omogoči prenos verige mRNA na GDP. Tako nastane kapa na verigi mRNA. Nato se veriga enako metilira kot pri konvencionalnem mehanizmu.

RNA trifosfataza

RNA trifosfataza (TPaza) je encim, ki je odgovoren za začetek postavljanja kape na 5’-konec koronavirusnega RNA. Njegova funkcija je cepiti fosfatno vez med fosfatoma β in γ prvega (iniciacijskega) nukleotida na 5’-koncu. Tako iz 5’-pppN konca nastane difosfatni 5’-ppN konec. Aktivnost encima so preverili s poskusom na kvasovkah seva YBS20 (cet1), ki v svojem genomu nimajo kromosomskega lokusa CET1 in so namesto njega vključili virusni gen za rast, ki vsebuje zapis za RNA TPazo. Delitev kvasovk je bila tako odvisna le od delovanja virusne TPaze. Izkazalo se je, da kvasovke ne morejo uporabljati virusnega gena zaradi različne organizacije in mehanizmov postavljanja kape.

Podobno aktivnost so opazili pri nestrukturnem proteinu nsp13. Nsp13 je povezan s helikazno aktivnostjo pri koronavirusih, in sicer deluje kot NTPaza. Ta tako kot TPaza cepi fosfatno skupino. Splošno mnenje je, da naj bi nsp13 imel tudi aktivno funkcijo v postavljanju kape, vendar njegova vloga še čaka na eksperimentalne dokaze.

RNA gvanilil transferaza

Odcep fosfata v prejšnji fazi predstavlja nastanek potencialnega mesta za vezavo nove molekule. Gvanilil transferaza (GTaza) je odgovorna za nastanek kovalentne vezi med 5’-koncem mRNA in GMP (pri konvencionalnem nastanku kape) oz. metiliranim GMP (pri vrsti alfavirusov). Tako nastane jedro kape (GpppN oz. m7GpppN). Podobno kot pri merjenju aktivnosti TPaze, so pregledali aktivnost GTaze na sevu kvasovk YBS2 (ceg1), ki nimajo kromosomskega lokusa CEG1, ki kodira GTaze kvasovk. Noben encim ni kazal GTazne aktivnosti. Dokazov za obstoj koronavirusne GTaze torej še ni.

Gvanin-N7 metiltransferaza

Gvanin-N7 metiltransferaza (N7-MTaza) je tretji encim, ki sodeluje pri sestavljanju kape na virusnih mRNA. Njegova funkcija je metilacija gvanilata, ki ga je GTaza dodala. Nastane tako imenovana struktura kape-0 (m7GpppN). Metilacija stabilizira strukturo kape in prepreči odcep gvanilata. Pri poskusu na kvasovkah YBS40 oz. sevom, ki nima kodiranih encimov MTaze, se je izkazalo, da nsp14 (N7-metiltransferaza in eksoribonukleaza) spodbuja rast celice in lahko prevzame funkcijo N7-MTaze. MTaza in nsp14 torej predstavljata potencialno tarčo za razvitje različnih protivirusnih zdravil.

Nsp14 je edina eksonukleaza, ki jo kodirajo RNA virusi, in lahko sodeluje pri kontrolnem branju pri prepisovanju. Poskusi kažejo, da se nsp14 nespecifično veže na mRNA in deluje kot MTaza. Nadaljnje študije kažejo, da je sposoben metiliranja različnih substratov, med katerimi so tudi GTP, dGTP in drugi analogi začetnih kap. Njegovo delovanje se poveča s prisotnostjo kofaktorja nsp10, s katerim tvori kompleks v stehiometriji 1:1, medtem ko prisotnost nsp16 ne vpliva na njegovo delovanje. Eksonukleazno domeno nsp14 predstavlja prvih 287 aminokislin, ki tvorijo katalitični motiv DEEDh. N7-MTazna domena je sestavljena iz β struktur in motivom cinkovega prsta, ki pa ni potreben za aktivnost encima. Na to domeno se veže molekula SAM, ki omogoči metilacijo.

Riboza 2’-O- metiltransferaza

Zadnji korak v nastanku kape je metiliranje strukture kape-0 na 2’-O prvega in drugega nukleotida mRNA molekule. Metilacija prvega nukleotida da strukturo kape-1, metilacija obeh pa strukturo kape-2. Metilacija je ključnega pomena pri izogibanju imunskega odziva na tujo virusno RNA. Reakcijo metiliranja opravlja encim riboza 2’-O- metiltransferaza. Pri koronavirusih jo sestavljata dva nestrukturna proteina, nsp16 (2’-O-metiltransferaza) in nsp10 (kofaktor 2’-O-metiltransferaze). Nsp16 vsebuje vezavno mesto za S-adenozil-L-metionin (SAM), ki je donor metilne skupine, nsp10 pa sodeluje pri nastanku aktivnega mesta in stabilizaciji verige mRNA. Za potek reakcije je nujno potrebna tvorba kompleksa teh dveh nestrukturnih proteinov. Substrat kompleksa je s cap-0 zaključena struktura mRNA molekule. Kompleks kaže največjo aktivnost, če je substrat z adeninom zaključena RNA molekula (m7-GpppA-RNA) in nižjo aktivnost ob prisotnosti RNA z gvaninom kot iniciacijskim nukleotidom. Veriga RNA mora biti dovolj dolga, da se lahko ugodno veže na kompleks encima; na kapo-0 vezan le en nukleotid ne sproži reakcije.

Detekcija tuje RNA v celicah

Vsak virus v svojem življenjskem ciklu sprosti svoj genetski material v notranjost celice gostitelja, zato so organizmi razvili različne načine za detekcijo tujega dednega materiala v svojih celicah. Tuje RNA molekule zaznavajo receptorji družine RLR (ang. RIG-I like receptors), ki obsega citosolne proteine RIG-I, MDA5 in LGP2. RLR receptorji so zgrajeni iz več domen, helikazne, C-končne in več CARD (ang. caspase activation and recruitment). Vezava ustrezne mRNA na receptor sproži signalno kaskado več kinaz, kar privede v sintezo transkripcijskih faktorjev za transkripcijo genov interferonov tipa ena. Interferoni-I so signalni peptidi, ki se sprostijo iz celice in delujejo avtokrino in parakrino z vezavo na receptorje interferonov-I (IFNAR). Vezava povzroči signalno pot JAK kinaz, ki vodi v izražanje transkripcijskih faktorjev za sintezo genov, ki upočasnijo transkripcijske procese virusov v celici. Molekula RNA, ki jo prepozna RLR receptor, se konča z dvema ali tremi fosfatnimi skupinami na 5'-koncu in ne sme biti metilirana. Pravilna vezava molekule RNA na receptor povzroči premik CARD domen, ki se lahko vežejo na proteine, ki sprožijo signalno pot. Celična mRNA je metilirana in se ne more vezati na RLR. Veliko RNA virusov (z izjemo koronavirusov) nima metilirane kape, zato njihov genetski material prepoznajo RLR receptorji in sprožijo imunski odziv.

Literatura

1. Chen, Y., & Guo, D. (2016). Molecular mechanisms of coronavirus RNA capping and methylation. Virologica Sinica, 31(1), 3–11. https://doi.org/10.1007/s12250-016-3726-4

2. Decroly, E., Ferron, F., Lescar, J., & Canard, B. (2012). Pre-mRNA splicing Conventional and unconventional mechanisms for capping viral mRNA. Nature Reviews Microbiology, 10, 51–65. https://doi.org/10.1038/nrmicro2675

3. Ogino, T., & Banerjee, A. K. (2007). Unconventional Mechanism of mRNA Capping by the RNA-Dependent RNA Polymerase of Vesicular Stomatitis Virus. Molecular Cell, 25(1), 85–97. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2006.11.013

4. Chen, Y., Su, C., & Ke, M. (2011). Biochemical and Structural Insights into the Mechanisms of SARS Coronavirus RNA Ribose 29-O-Methylation by nsp16/nsp10 Protein Complex. PloS Pathog, 7(10). https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1002294