Metabolični inženiring gram-negativnih bakterij s transpozonskim sistemom

Uvod

Naloga sintezne biologije je predvsem v načrtovanju in izdelavi novih bioloških sistemov, konstruktov in naprav za aplikativne namene [1]. Transpozonski sistem predstavlja pri ustvarjanju bakterij z novimi lastnostmi nekaj prednosti v primerjavi s klasično uporabo plazmidov. Plazmid je lahko v bakteriji prisoten v nekaj kopijah, kar lahko predstavlja preveliko breme za samo celico, ki jo želimo uporabiti v biotehnološkem procesu. Uporaba t.i. minitranspozonskega sistema, ki temelji na delovanju transpozonskega sistema Tn5, se je začela že v 90-ih letih 20. stoletja [2,3]. Uporabljalo se ga je predvsem za insercijsko mutagenezo, identifikacijo nativnih promotorjev ter vnos tujih genov v bakterijski genom. Slednji se je izkazal tudi za uporabno orodje pri metaboličnem inženiringu gram-negativnih bakterij, saj lahko ta pristop uvede za celico manjše metabolično breme [4].

Transpozonski sistem Tn5

Tn5 je prokariontski transpozonski sistem in je sestavljen iz dveh insercijskih zaporedij IS50L in IS50R, med katerima se nahaja zaporedje, ki vsebuje tri gene, ki zapisujejo odpornost proti antibiotikom (kanamicin, streptomicin, bleomicin). Vsako insercijsko zaporedje vsebuje zunanje in notranje zaporedje obrnjene ponovitve dolžine 19 baznih parov. Zunanje in notranje zaporedje obrnjenih ponovitev se med seboj razlikujeta v sedmih baznih parih. Zapis za transpozazo (Tnp) se nahaja v IS50R. Transpozaza lahko tako premakne cel sistem Tn5 preko zunanjih zaporedij obrnjenih ponovitev obeh insercijskih zaporedij ali pa posamezno insercijsko zaporedje preko zunanjega in notranjega zaporedja obrnjenih ponovitev. Transpozaza Tn5 deluje preko reži-in-prilepi mehanizma (ang. cut and paste). Za sam proces transpozicije je potrebna dimerizacija transpozaze in Mg(2+) ion. Sistem je tesno reguliran. Delna regulacija je uravnana z inhibitornim proteinom Inh, katerega zaporedje je identično transpozazi, le da mu manjka 55 aminokislin N-konca proteina. Zapis za Inh se nahaja v istem delu sistema, inhibicija transpozicije pa predstavlja nastanek neproduktivnih multimerov lnh s Tnp in tako onemogoča dimerizacijo Tnp. Pri prenosu v tarčno zaporedje pride do podvojitve zaporedja 9 baznih parov [5]. Različne ravni regulacije sistema omogočajo nizko pojavnost transpozicije. Intrinzični faktorji regulacije tako predstavljajo šibek transpozazni promotor, preprečevanje prepisovanja gena za transpozazo zaradi neučinkovite terminacije predhodnjega prepisa (ang. transcriptional readthrough) in inhibitorni protein lnh. Prisotni so prav tako ekstrinzični faktorji, kot so metilacija transpozaznega promotorja in prisotnost regulatorjev transpozicije (npr. H-NS, LexA, Fis,…) [6]. Tarčno mesto integracije s strani transpozaze Tn5 je dokaj naključno z rahlo preferenco integracij v zaporedja z G/C pari na koncih tarčnega zaporedja DNA [4,7].

Plazmidi mini-Tn5

Plazmidi mini-Tn5 omogočajo prenos zapisa v genom na osnovi transpozonskega sistema Tn5. Prva takšna je bila serija plazmidov pUT [8]. Tej so sledili manjše, preurejene in izboljšane različice plazmidov, kot so plazmid pBAM-1 [9] in serija plazmidov pBAMD1-x [4]. V splošnem vsi plazmidi mini-Tn5 vsebujejo določene strukturne elemente in lastnosti. Te lastnosti so (i) zapis za odpornost proti ampicilinu (bla), ki se nahaja na plazmidnem ogrodju; (ii) mesto začetka podvojevanja iz plazmida R6K (ori(R6K)), ki omogoča podvajanje plazmida v ozkem spektru tarčnih organizmov (tisti, ki vsebujejo gen pir); (iii) mesto začetka prenosa (oriT) in (iv) zapis za transpozazo (tnpA), ki leži zunaj (v) mini-transpozonskega modula (ta vsebuje zunanji prepoznavni zaporedji za transpozazo, mesto MCS in selekcijski marker) [4,8,9]. Plazmidi, ki temeljijo na delovanju transpozaze Tn5 in s tem omogočajo integracijo genov v genom bakterijske celice, imajo nekatere prednosti v uporabi pred klasičnimi plazmidi. Omogočajo (i) kloniranje velikih konstruktov in njihovo integracijo v genom; (ii) stabilnost konstruktov dalj časa tudi brez selekcijskega markerja in (iii) zaporedni vnos različnih konstruktov [4,9]. Zaporedni vnos različnih konstruktov temelji na lastnosti, da transpozaza Tn5 deluje in omogoča prenos mini-transpozonskega modula v bližini (»in cis«) in ob prenosu izgubi svojo vlogo. Tako katalizira prenos zaporedja, prisotnega na plazmidu, ne glede na prejšnje vstavitve v genom. V primeru, da vsak modul vsebuje svoj selekcijski marker, lahko enostavno izberemo transformante. Takšna lastnost transpozaze Tn5 prav tako pomeni nezmožnost prenosa možnih prepoznavnih zaporedij v genomu tarčnega organizma in s tem zmanjšano potencialno toksičnost [4,9]. Eden izmed identificiranih neželjenih učinkov je možna integracija plazmidnega ogrodja v genom bakterijske celice. Kljub temu lahko z ustreznimi metodami preverimo, ali je do integracije ogrodja prišlo [4]. Plazmidi mini-Tn5 so se izkazali za uporabno orodje pri inženiringu gram-negativnih bakterij [2,3,4,8,9].

Metabolični inženiring

Metabolični inženiring preko uporabe genetskega inženiringa spreminja metabolizem organizma. To lahko počne s spreminjanjem že obstoječe biokemijske poti ali pa ta uvede komponente nove poti z namenom proizvodnje specifičnega metabolita v večji meri [10]. Ob uvedbi novih metaboličnih poti v organizem moramo paziti na ustrezno nizke ravni izražanja določenih genov. Previsoko oz. neuravnovešeno izražanje genov za encime, ki katalizirajo biosintezo, bi lahko vodilo v preveliko metabolično breme za celico. Prav tako so visoke ravni intermediatov lahko za celico toksične. Poleg usklajenega in kontroliranega izražanja genov je v ospredju tudi njihova genetska stabilnost v tarčnem organizmu. Usklajeno in kontrolirano izražanje genov ohranja normalen celični fenotip. Eden izmed takšnih želenih fenotipov je ohranitev normalne celične rasti v čimbolj enostavnem gojišču [11]. Transpozonski sistem predstavlja ugodno rešitev za metabolični inženiring. Omogoča vnos velikih konstruktov, kar je v primeru vnosa nove metabolične poti v organizem še posebej zaželjeno. Prav tako je genetska stabilnost vnesenih konstruktov večja, saj so ti vstavljeni v genom in tako bolj stabilni kot plazmidi, kjer lahko pride do njihovega izgubljanja [4]. Vstavljanje konstruktov v genom preko uporabe transpozonskega sistema Tn5 je naključno in posledično bo prišlo tudi do različnih ravni izražanja konstruktov, saj bodo ti locirani na različnih predelih genoma. Ta lastnost nam omogoča, da lahko izberemo transkonjuganto oz. transformanto, katere profil izražanja nam ustreza [4].

Sinteza poli(3-hidroksibutirata)

Poli(3-hidroksibutirat) oz. PHB je poliester sestavljen iz monomernih enot 3-hidroksibutirata. PHB predstavlja termoplastičen in biokompatibilen material, katerega enostavno razgradijo številne bakterije. Tako predstavlja PHB perspektiven, okolju prijazen material. Njegov nastanek iz acetil koencima A (acetil-CoA) navadno katalizirajo trije encimi (katere zapisujejo geni pha). Pri C. necator so to encimi PhaA, PhB in PhaC. PhaA, ki je 3-ketoacil-CoA tiolaza, kondenzira molekuli acetil-CoA v 3-acetoacetil-CoA. Drugi encim v sintezni poti je PhaB, ki je od NADPH odvisna 3-acetoacetil-CoA reduktaza. V zadnjem koraku sintezne poti katalizira polimerizacijo 3-hidroksibutiril-CoA encim PhaC, ki je poli(3-hidroksialkanoat)sintaza. Do sedaj so pridobili številne seve E. coli, katerim so vstavili različne gene pha in so bili zmožni akumulacije polimera. Za sedanje produkcijske sisteme PHB so značilne številne slabosti. Ena izmed takšnih je pomanjkanje regulacije prepisovanja genov pha, saj sinteza in akumulacija PHB povzroča neravnovesje v dostopnosti kritičnih nutrientov. Tako povzroča konstitutivno izražanje teh genov za celico metabolično breme in se kaže v odvisnosti akumulacije PHB od rasti celic. Tako je za celično tovarno z lastnostjo proizvodnje PHB pomembno uravnavanje prepisovanja genov pha in s tem raven akumulacije PHB [4].

Metabolično pot za sintezo PHB v E. coli je možno uvesti tudi preko transpozonskega sistema Tn5. Ta ponuja prednosti, kot so integracija večjih konstruktov v genom, njihova stabilnost brez selekcijskega pritiska in zaradi naključne integracije v genom izbira transkonjugante oz. transformante z željenim profilom izražanja konstruktov. Ker je acetil-CoA intermediat tudi za druge metabolične poti, je smiselno preveriti, v katerih je ta prisoten, saj bi drugače druge metabolične poti porabljale ključno molekulo potrebno za sintezo PHB. V E. coli se acetil-CoA pretvarja tudi v acetat preko encimov Pta (fosfotransacetilaza) in AckA (acetat kinaza). Omenjena pretvorba porablja znatno količino acetil-CoA iz centralnega metabolizma celice tako v prisotnosti kot v odsotnosti kisika. 5,3 kb velik fragment DNA, ki vsebuje vse tri gene pha iz C. necator, je bil vstavljen v E. coli preko plazmidov mini-Tn5 . Geni pha so bili vstavljeni v sev ∆pta E.coli (kateremu je onemogočeno pretvarjanje acetil-CoA v acetat) preko dvostarševskega parjenja (ang. biparental mating). Celice so akumulirale polimer PHB v razponu 3 % - 78 % stopnje akumulacije, dosežene s klasičnim plazmidnim sistemom. Pri celicah, katerim je bil vnesen fragment preko klasičnega plazmidnega sistema, je bila celična rast ovirana zaradi metaboličnega bremena. Prav tako je bila motena rast opažena v nespremenjenem sevu ∆pta, ki je najverjetneje posledica sprememb v zalogi acetil-CoA. Ob karakterizaciji transkonjugante z najvišjo stopnjo akumulacije PHB, kateri je bil fragment vnesen preko transpozonskega sistema, je bila opažena povrnitev lastnosti celične rasti divjega tipa (85 % podobnost) in najvišja celična gostota v primerjavi z ostalimi sevi (divji sev, sev ∆pta in sev ∆pta transformiran s klasičnim plazmidnim sistemom). Ob gojenju bakterij v mediju LB brez selekcijskega pritiska, je sev, spremenjen s transpozonskim sistemom, ohranil fenotipske lastnosti in raven akumulacije polimera PHB, medtem ko je bila za sev s klasičnim plazmidnim sistemom značilna segregacijska nestabilnost, kjer se je fenotip seva spremenil in raven akumulacije PHB znižala [4].

Zaključek

Na primeru vnosa poti, ki omogoča sintezo in akumulacijo PHB se dobro opazijo prednosti uporabe transpozonskega sistema. Ta omogoča kloniranje velikih fragmentov, kar pride še posebej priročno pri metaboličnem inženiringu. Prav tako tu ne pride do segregacijske nestabilnosti in konstrukti so stabilni tudi v odsotnosti selekcijskega pritiska. Čeprav se kontrukt nahaja le v eni kopiji na celico (napram več kopijam pri klasičnem plazmidnem sistemu), lahko ta doseže visoke ravni izražanja, ko se ta vgradi na primerno mesto v genomu. Tudi naključna integracija v genom predstavlja svojevrstno prednost, kjer lahko izberemo transkonjugante oz. transformante, katerih profil izražanja nas zanima oz. nam ustreza. S takšnim pristopom lahko zmanjšamo metabolično breme in uvedemo primerno regulacijo prepisovanja vnesenih genov. Tako transpozonski sistem na osnovi plazmidov mini-Tn5 predstavlja obetavno orodje pri metaboličnem inženiringu gram-negativnih bakterij.

Literatura in viri

1. Tadashi N, Eckford AW, Haraguchi T. Molecular Communication. Cambridge University Press, 2013.

2. Herrero M, De Lorenzo V, Timmis KN. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. J Bacteriol. 1990;172(11):6557-6567.

3. Lorenzo VDE, Herrero M, Jakubzik UTE. Mini-TnS Transposon Derivatives for Insertion Mutagenesis , Promoter Probing , and Chromosomal Insertion of Cloned DNA in Gram-Negative Eubacteria. Notes. 1990;172(11):6568-6572.

4. Martínez-García E, Aparicio T, de Lorenzo V, Nikel PI. New transposon tools tailored for metabolic engineering of gram-negative microbial cell factories. Front Bioeng Biotechnol. 2014;2:46.

5. Steiniger-White M, Rayment I, Reznikoff WS. Structure/function insights into Tn5 transposition. Curr Opin Struct Biol. 2004;14(1):50-57.

6. Haniford DB, Ellis MJ. Transposons Tn 10 and Tn 5. Microbiol Spectrum. 2015;3(1):1-15.

7. Lodge JK, Weston-hafer K, Douglas E. Transposon Tn5 Target Specificity: Preference for Insertion at G/C Pairs. Genetics. 1988;120:645-650.

8. Lorenzo V, Herrero M, Sanchez JM, Timmis KN. Mini-transposons in microbial ecology and environmental biotechnology. FEMS Microbiol Ecol. 1998;27(3):211-224.

9. Martínez-García E, Calles B, Arévalo-Rodríguez M, de Lorenzo V. pBAM1: an all-synthetic genetic tool for analysis and construction of complex bacterial phenotypes. BMC Microbiol. 2011;11(1):38.

10. Metabolic engineering. [citirano 2.12.2015] http://www.nature.com/subjects/metabolic-engineering

11. Keasling JD. Synthetic Biology for Synthetic Chemistry. ACS Chemical Biology. 2008;3(1):64-76.