Metabolno inženirstvo Klebsiella pneumoniae za produkcijo cis,cis-mukonične kisline
UVOD
Spojine z dodano vrednostjo za svojo sintezo potrebujejo začetne spojine, ki večinoma izhajajo iz naftne industrije. To predstavlja vedno večji problem, saj se pri pridobivanju teh začetnih spojin v atmosfero izpusti velike količine toplogrednih plinov. Ekološke težave pa niso edine, ki ta način pridobivanja seboj prinese. Potrebno je tudi vzeti v obzir vedno večje ekonomsko breme, ki ga predstavljajo vedno višje cene surove nafte. Zaradi teh in mnogih drugih razlogov je potrebno zmanjšati našo odvisnost od fosilnih goriv. Možna rešitev tega specifičnega problema je mikrobna produkcija teh, začetnih spojin. Primer ravno tega je adipična kislina (AK), prekurzor najlona-6,6. Omenjeno kislino je možno pridobiti preko mikrobne sinteze, natančneje njen prekurzor cis,cis-mukonično kislino (ccMA), ki je naravni metabolni intermediat mnogih bakterijskih vrst. Ena izmed teh je tudi Klebsiella pneumoniae, ki je ko produkcijski mikroorganizem bila izbrana zaradi pestrega nabora možnih virov ogljika za njeno preživetje. Druagče bakterija sodi med patogene mikroorganizme saj povzroča mnoge bolnišnične okužbe, pljučnice in okužbe sečil. Raziskovalci so preko izbijanja določenih genov in prekomerne ekspresije drugih preusmerili znotrajcelični ogljikov tok in tako pripravili mikroorganizem, ki je ob optimalnih pogojih sposoben produkcije 2,1g ccMA na liter kulture.
METODE IN MATERIALI
Genetske manipulacije so opravili znotraj bakterije Eschericchia coli DH5α, ki so jo gojili v navadnem Luria-Bartani (LB) gojišču. Kot izvorni sev K. pneumoniae so uporabili sev KMK-02, ki je bil v njihovem laboratoriju pripravljen v okviru druge raziskave. Tamu sevu sta utišana gena wagG in ldhA. Prvi sodeluje pri sintezi lipopolisaradidov, ki so pomembni za patogenost bakterije in drugi sodeluje pri sintezi mlečne kisline. Genske konstrukte so v bakterije vnašali preko elektroporacije. Za utišanje določenih genov znotraj K.pneumoniae so uporabili »α red« rekombinacijski sistem in za prekomerno ekspresijo so uporabili eksresijski plazmid pBTBX-2. Analiza izvenceličnih metabolitov je bila izvedena preko HPLC in detekcija katehola ter ccMA preko merjenja absorbance pri 225nm.
REZULTATI IN DISKUSIJA
K. pneumoniae proizvaja ccMA kot naravni metabolni intermediat v sintezi acetil in sukcinil-CoA, preko katehol razgradnje poti. Najprej so preverili, če izvorni sev KMK-02 proizvaja ccMA. Ugotovili so, da po 24h proizvede le 34mg/ml katehola, ki je prekurzor ccMA. Naslednji korak je bil preusmerjanje znotrajceličnega ogljikovega toka v smeri produkcije ccMA preko delecije šikimatne poti sinteze aminokislin. To so naredili z izbitjem gena aroE, ki zapisuje za 3-dehidroksiškimat dehidrogenazo. Nastali sev KMK-101 je proizvedel 343g/ml katehola, vendar ccMA e vedno niso mogli zaznati. Možen odgovor so videli v odtekanju nastalega bazena ccMA, preko delovanja mukonolat cikloizomerazev acetil in sukcinil-CoA. Torej so izbili še gen catA, ki zapisuje prej omenjen encim. Nastali sev (KMK-102) je prizvedel plibližno enako količino katehola in ccMA še vedno niso mogli zaznati. Sklepali so, da težava želi v nezadostnem pritekanju ogljika v želeno metabolno pot. Torej so izbili represor tyrR (sev KMK-103), ki ob zadostnih količina aromatskih aminoskilin preprečuje njihovo sintezo preko šikimatne poti. Zadnji sev, ki so ga pripravili preko izbijanja genov je bil sev KMK-107. Tamu so izbili gen pcaH, ki zapisuje protokatehat 3,4-dioksigenazo saj ta encim preusmeri ogljikov tok starn od ccMA. Zadnji sev (KMK-107) je preizvedel več katehola kot KMK-103, vendat ccMA še vedno ni bil zaznan. Torej raziskovalci sklepali, da pretvorba iz katehola v ccMA ne poteka dovolj hitro. Za pretvorbo je odgovoren encim katehol 1,2-dioksigenaza (catA). Dodane kopije catB so raziskovalci vnesli v vse pripravljene seve. Končni sev se je imenoval KMK-107C in je proizvedel 2,1g ccMA na litrer kulture po 72h.
