MiRNA v bolezenskih stanjih

Uvod

Mikro RNA (miRNA) so nekodirajoče ribonukleinske kisline, ki post-transkripcijsko regulirajo ekspresijo genov pri evkariontih. V človeku jih poznamo približno 1900 vrst, prvič pa so bile odkrite šele pred približno tridesetimi leti. V povprečju so miRNA dolge 22 nukleotidov, interagirajo pa v glavnem s specifičnimi sekvencami v 3' neprevajajoči regiji (3' UTR) v mRNA molekulah, katerim preprečijo nadaljnjo prevajanje v proteine. Mikro RNA so ključne za normalno delovanje organizmov, zato ne preseneča, da so pogosto implicirane pri različnih bolezenskih stanjih. Večinoma se nahajajo v notranjosti celice, ker pa so občasno uporabljene za komunikacijo med celicami, jih lahko najdemo tudi v krvnem serumu. Zaradi tega lahko služijo kot zelo dobri bio-označevalci pri diagnozi določenih bolezni.

Biogeneza miRNA

Najprej pa malo o biogenezi miRNA, ki se deli na kanonično in nekanonično. Kanonična se začne tako, da gen za miRNA prepiše RNA polimeraza II v primarni transkript, imenovan pri-miRNA. Taki geni so lahko monocistronski (samostojni), policistronski (skupek miRNA) ali pa intronski, torej skriti znotraj protein kodirajočih genov. Nastale pri-miRNA so dolge nekaj sto nukleotidov in imajo v sredini značilno obliko z lasnične zanke. To zanko nato prepozna jederni protein DGCR8, med drugim s pomočjo motiva GGAC z metiliranim adeninom, ta pa primarni transkript miRNA privede do jedrne eksoribonukleaze imenovane Drosha. Ta encim asimetrično odreže vse odvečne nukleotide, ki niso del lasnične zanke, tako da njen 3' konec dobi dva štrleča nesparjena nukleotida. Nastala zanka je prekurzor zrele miRNA, zato dobi ime pre-miRNA in je s pomočjo kompleksa eksportina 5 in Ran-GTP transportirana v citosol za dokončno procesiranje. To omogoča citosolna endoribonukleaza Dicer, ki odstrani zanko in s tem naredi dupleks dveh komplementarnih ali skoraj komplementarnih miRNA verig (to sta 5p iz 5' konca pre-miRNA in 3p iz 3' konca pre-miRNA). Zdaj je samo še en korak do nastanka končnega kompleksa za utišanje genov imenovanega RISC (RNA induced silencing complex). Dupleks miRNA mora srečati protein AGO2 iz družine argonavtnih proteinov, ki se poveže z eno (vodilno) verigo miRNA, drugo (potniško) pa odvrže. Katero izmed obeh izbere za vodilno je odvisno od stabilnosti njunih 5' koncev, in sicer vzame tisto z manj stabilnim, saj se najprej veže na njeno fosfatno skupino. Ena veriga miRNA vezana na AGO2 protein je zdaj najbolj osnoven RISC kompleks, ki pa ima po navadi zraven še številne druge proteine. Nekanonična biogeneza izpusti enega ali več izmed korakov kanonične, predvsem Drosha ali Dicer kompleksa. Prvega lahko preskočijo molekule RNA, ki so že podobne Dicer substratom. Primer takih so t.i. mirtroni, torej miRNA iz intronov drugega gena, ki po obdelavi s spliceosomom in debranching encimom že dobijo obliko lasnične zanke in lahko s pomočjo eksportina 1 izstopijo iz jedra ter reagirajo z Dicerjem. V primerjavi s tem pa lahko korak rezanja z Dicer kompleksom preskočijo miRNA molekule, ki so prekratke, da bi reagirale z njim. Te po obdelavi v jedru lahko v obliki pre-miRNA kar direktno vstopijo v AGO2, kjer s pomočjo dodatnih ribonukleaz do konca dozorijo.

Mehanizem delovanja miRNA

Zadnja stvar, ki jo moramo povedati preden se osredotočimo na bolezni, je še mehanizem delovanja miRNA. Ko je enkrat povezana v kompleks RISC s proteinom AGO2, se lahko veže na določene regije na mRNA imenovane MRE (odzivne elemente za miRNA), ki se po navadi nahajajo za kodirajočo regijo, včasih pa tudi v njej. Kaj se zgodi naslednje je odvisno od stopnje komplementarnosti med miRNA in MRE. Če je ta popolna je dvojna vijačnica RNA dovolj trdna in stabilna, da lahko AGO2 direktno prereže mRNA in s tem sproži njegovo hitro razgradnjo s pomočjo različnih citosolnih eksonukleaz. Pogosto v živalskih celicah pa komplementacija ni popolna in je večinoma omejena na 7 prepoznavnih nukleotidov na 5' koncu miRNA. Ker AGO2 tu ne more direktno rezati se takrat translacija blokira na drugačen način, in sicer s pomožnimi proteini v kompleksu RISC. Ti lahko recimo preprečijo vezavo ribosomskih iniciacijskih faktorjev, ali pa skrajšujejo zaščitni poliA rep na mRNA ter mu odstranijo 5' kapico. Pri tem je pomemben povezovalni protein GW182, ki nase veže deadenilacijska kompleksa PAN2/3 in CCR4-NOT ter DCP2 (decapping protein). To skupaj povzroči destabilizacijo mRNA molekule in posledično njeno razgradnjo, kar efektivno utiša gen, ki jo kodira.

Bolezni

Kardiovaskularne bolezni

Pri kardiovaskularnih boleznih imajo miRNA dvojno vlogo – služijo kot potencialni biomarkerji in aktivno sodelujejo v patoloških procesih srčne preobrazbe. Med pogosteje preučenimi so miR-1 in miR-133, ki uravnavata rast in diferenciacijo kardiomiocitov, ter miR-155, ki sodeluje pri vnetnih odzivih v žilni steni, zlasti pri aterosklerozi. Posebno pomembna pa je miR-21, katere izražanje se močno poveča v srčnem tkivu ob izpostavljenosti stresnim dejavnikom, kot sta hipoksija in oksidativni stres, ter pri srčnem popuščanju. MiR-21 spodbuja razvoj srčne fibroze, pri čemer igra ključno vlogo v signalni poti TGF-β/Smad. Aktivacija TGF-β vodi do povečane ekspresije miR-21 v srčnih fibroblastih, kar povzroči zaviranje Smad7 – zaviralca signalizacije TGF-β. Posledično pride do pospešene aktivacije Smad2/3 in povečane transkripcije genov za zunajcelični matriks, kot sta kolagen tipa I in fibronectin, ter označevalcev fibroblastne aktivacije, kot je α-SMA. Poleg tega miR-21 zavira izražanje proteina CADM1, kar vodi v povečano aktivnost transkripcijskega faktorja STAT3, ki dodatno spodbuja proliferacijo fibroblastov in napredovanje fibroze. Takšna regulacija ne vpliva le na strukturo srca, temveč tudi na njegovo funkcijo. Poleg patogenetske vloge pa imajo določene miRNA tudi diagnostični potencial – na primer miR-208a in miR-499, ki v nekaj urah po miokardnem infarktu v serumu narasteta za 30 do 100-krat, kar zanesljivo odraža akutno poškodbo kardiomiocitov.

Bolezni prebavil

Na področju prebavil je bilo narejenih veliko raziskav, predvsem v kontekstu rakov prebavil, kot sta rak želodca in črevesa. Med najbolj preučenimi je spet miR-21, ki je pogosto močno prekomerno izražena v tumorskih tkivih in deluje kot onkogen. Pri raku črevesa povišana miR-21 spodbuja nastajanje tumorjev prek več mehanizmov. Ena ključnih tarč miR-21 je tumorski supresorski gen PDCD4 (Programmed Cell Death 4), katerega zaviranje vodi do povečane proliferacije in zmanjšane apoptoze tumorskih celic. Poleg tega miR-21 cilja tudi na PTEN, pomemben zaviralec signalne poti PI3K/AKT, kar omogoča aktivacijo te poti in s tem dodatno spodbuja celično preživetje, rast in migracijo. Pri zdravljenju CRC se je izkazalo, da visoka raven miR-21 zmanjšuje občutljivost na kemoterapijo s 5-fluorouracilom (5-FU), saj zavira izražanje proteinov, odgovornih za popravljanje DNK in induciranje apoptoze. Povečana ekspresija miR-21 je tako ne le indikator napredovale bolezni, temveč tudi potencialni napovedni označevalec slabšega odziva na terapijo. Nasprotno pa so nivoji tumorsko supresorske miRNA, kot sta miR-145 in miR-34a, pogosto zmanjšani, kar odstrani naravne zavore na rast tumorja. Zaradi tega se profili miRNA v GI rakih obravnavajo kot dragoceni diagnostični in prognostični biomarkerji ter kot zanimive terapevtske tarče.

Nevrološke motnje

Pri težavah živčnega sistema povezanih z miRNA, je njihova prenizka raven največji in najpogostejši vzrok bolezni, saj so raki živčevja nekoliko redkejši. Eden najbolje raziskanih primerov je miR-124, ki je pri Alzheimerjevi bolezni (AD) izrazito znižan. V zdravih možganih miR-124 deluje kot regulator diferenciacije nevronov in vzdrževanja sinaptične funkcije, poleg tega pa neposredno zavira izražanje BACE1 – encima, odgovornega za začetni korak pri tvorbi amiloid-beta peptidov. Znižana raven miR-124 pri AD pomeni znižanje BACE1, kar vodi v povečano proizvodnjo amiloid-beta plakov, ki so značilni za bolezen. Poleg tega zmanjšana miR-124 oslabi sinaptično stabilnost in prispeva k vnetnim odzivom v centralnem živčnem sistemu. Tudi druge miRNA, kot sta miR-132 (vpliva na nevralno plastičnost) in miR-29 (regulira fosforilacijo tau proteina), so v modelih AD spremenjene, kar dodatno poglablja patološki proces. V primeru Parkinsonove bolezni pa je usodna izguba miR-133b, ki vpliva na diferenciacijo in delovanje dopaminergičnih nevronov. Zaradi omenjenih lastnosti služijo miRNA kot zanesljivi biomarkerji pri detekciji bolezni živčevja, obenem pa raziskovalci preučujejo terapevtsko uporabo njihovih posnemovalcev, za upočasnitev ali celo ozdravljanje nevrodegeneracije.

Napake v reproduktivnem sistemu

MiRNA so kot regulatorji pomembni tudi v reproduktivnih tkivih, tako pri moških, kot ženskah. Pri ženskah miR-21 omogoča preživetje in zorenje jajčnih celic. Njegova prekomerna izraženost pa je povezana z neplodnostjo v obliki PCOS (sindrom policističnih jajčnikov). Pri tej bolezni so nivoji miR-21 in tudi miR-93 dokazano povišani v celicah granuloze (celice, ki obdajajo oocite). Z PCOS je povezano tudi abnormalno izražanje drugih miRNA-jev (npr. miR-27a-3p, miR-203a-3p in miR-494-3p). Pri rakih na reproduktivnem sistemu so zopet prisotne miRNA v nenaravnih koncentracijah. Na primer miR-146a-5p je dokazano prisotna v povečani količini v krvnem serumu pri bolnicah z rakom na jajčnikih (pri drugih tipih raka so vpletene tudi miR-200, miR-21 in miR-214). Pri ženskah je potencialni razlog za neplodnost irgularno izražanje miR-34 in miR-449, ki ključne za nastanek migetalk v jajcevodu. Pri moških MiRNA iz teh družin delujejo podobno, v večji meri se izražajo med spermatogenezo in kontrolirajo nastanek bička. Do neplodnosti vodi tudi pomanjkanje miR-383, ki je manj izražena pri moških, ki imajo težave z nepopolnim zorenjem spermijev.

Bolezni ledvic

MiRNA igrajo vlogo tudi v delovanju in pojavu bolezenskih stanj ledvic. Primer tega je miR-192, ki igra vlogo pri DN (diabetična nefropatija). Kot posledica TGF-β1 signalne poti pride do povečanja izražanja te miRNA, ki inhibira specifične transkripcijske represorje in posledično omogoči tranzicijo epitelnega tkiva v mezenhimsko in pa nalaganje kolagena, kar vodi v fibrozo (brazgotinjenje) ledvic. Kar je pri miR-192 zanimivo, je dejstvo da, je njena koncentracija v krvnem serumu zmanjšana v začetnih fazah DN, v poznejših pa je zvišana v urinu in ledvičnem tkivu. To dejstvo jo naredi primerno kot biomarker za spremljanje napredovanja tega bolezenskega stanja. Kot biomarker bi bila lahko potencialno uporabljena (skupaj z miR-204) tudi ob akutnih poškodbah ledvic. Nekatere izmed ostalih relevantnih miRNA na tem področju so še: miR-194 in miR-215, katerih znižano izražanje je povezano z rakom ledvic; miR-21, miR-126 in miR-141, ki se (kot miR-192) povečano izražajo ob akutnih poškodbah; miR-92a, miR-126 in miR-223, katerih spremembe v stopnji izražanja so povezane s kronično odpovedjo ledvic (CKD).

Napake kosti in mišic

Ena pomembnejših oziroma zanimivejših miRNA na tem področju je miR-206. Ta je dokazano prisotna v povečanih količinah v osteoblastih bolnikov z osteoporozo, torej jo lahko uporabimo kot biomarker. Deluje tako, da z vezavo na mRNA prepreči translacijo proteina Cx43 (koneksin 43), ki tvori presledkovne stike med osteoblasti, in dokazano preprečuje osteoporozo. Nižja kostna gostota korelira tudi z nižjimi nivoji miR-21 v krvi, medtem ko njena povečana koncentracija spodbuja k vnetje mišic. MiR-214 izkazuje negativno korelacijo s proteinoma BGLAP in ALP, katerih prisotnost po navadi povezujemo s tvorbo kosti. Zanjo je značilno, da se njeno izražanje s staranjem zmanjšuje. Vredno je omeniti še miR-1 in miR-133, ki potencialno inhibirata rasne faktorje, kot je IGF-1 in tako omogočata rast mišic po vadbi. Ta sklep pride iz raziskave (na miših), ki je pokazala, da ob redni vadbi njuni nivoji močno padejo. Nekatere druge miRNA v povezavi z boleznimi kosti in mišic: miR-221 in miR-222, ki inhibirata diferenciacijo mioblastov; miR-141, ki zavira diferenciacijo in obstoj kostnih matičnih celic (BMSCs).

Zaključek

V seminarju smo poskusili povzeti nekaj izmed zanimivejših primerov miRNA in bolezenskih stanj v povezavi z njimi. To področje je izjemno široko in relativno novo. Posledično zahteva še veliko novih raziskav, ki bi potrdile in uveljavile njihovo vlogo kot zaviralci bolezenskih stanj in pa biomarkerji.

Viri

Alizadeh, Mehdi, idr. „MicroRNAs in Disease States“. Clinica Chimica Acta, let. 569, marec 2025, str. 120187. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1016/j.cca.2025.120187.

O’Brien, Jacob, idr. „Overview of MicroRNA Biogenesis, Mechanisms of Actions, and Circulation“. Frontiers in Endocrinology, let. 9, avgust 2018, str. 402. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.3389/fendo.2018.00402.

Lian, J., idr. „Downregulation of microRNA-383 Is Associated with Male Infertility and Promotes Testicular Embryonal Carcinoma Cell Proliferation by Targeting IRF1“. Cell Death & Disease, let. 1, št. 11, november 2010, str. e94–e94. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1038/cddis.2010.70.

Salamanna, Francesca, idr. „Sharing Circulating Micro-RNAs between Osteoporosis and Sarcopenia: A Systematic Review“. Life, let. 13, št. 3, februar 2023, str. 602. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.3390/life13030602.