Modeli konjugacije med črevesnimi bakterijami

Uvod

Naraščanje protimikrobne odpornosti (AR) in genov virulence (VG) na svetovni ravni je kritično. Bakterije širijo genski material vertikalno ali horizontalno s konjugacijo, transformacijo ali transdukcijo. Horizontalni prenos genov (HGT), zlasti s konjugacijo bakterij, je pomemben za širjenje AR. HGT se pojavlja v različnih okoljih in je glavno gonilo bakterijske evolucije, saj omogoča hitro pridobivanje novih lastnosti. AR, virulenca in njihov prenos med bakterijami povzročajo velike zdravstvene težave, zlasti v črevesni mikrobioti, ki deluje kot rezervoar genov AR (ARG) in HGT. Bakterijske interakcije in HGT v človeškem črevesju zaradi eksperimentalnih izzivov raziskujejo le redke študije, ki se zanašajo na opazovalne študije ali živalske modele.

Konjugativni elementi

Klasično obstajata dve vrsti konjugativnih vektorjev: integrativni in konjugativni elementi ter konjugativni plazmidi. Oba prenašata genetske informacije med bakterijskimi celicami, vendar se razlikujeta po mehanizmih in vzdrževanju. Zahtevata fizično interakcijo, prepoznavanje prejemne celice in prenos DNK, ki ga posredujejo sistemi za izločanje tipa štiri (T4SS), kot so tra, trw in trb. Ti sistemi kodirajo beljakovine za sestavljanje spolnih pilusov, pritrditev in rekrutiranje celic prejemnic. Po sestavi in rekrutiranju helikaze odvijajo DNK ter pomagajo pri rezanju DNK, replikaciji in prenosu na notranjo stran konjugacijskega mehanizma. Prenosna veriga DNK se nato v odvisnosti od ATP prenese v bakterije prejemnice, kjer se cirkularizira, izrazijo se geni in replicira mobilni element.

Integrativni konjugativni elementi

Integrativni konjugativni elementi (ICE) so vektorji DNK, ki se med konjugacijo prenašajo med bakterijami. V nasprotju s plazmidi se ICE nahajajo v gostiteljskem kromosomu in se integrirajo v ciljno DNK prek posebnih mest za pritrditev. Pridobijo lahko nove genetske regije in potencialno širijo gene za odpornost proti antibiotikom (ARG). ICE se prenašajo v različnih bakterijskih gostiteljih, vključno s tistimi v človeškem črevesju. Davies in drugi so identificirali ICEde3396 v Streptococcus dysgalactiae ter pokazali njegov konjugativni prenos in potencialno vlogo pri širjenju odpornosti proti antibiotikom.

Konjugativni plazmidi

Konjugativni plazmidi so krožne molekule DNK, ki jih bakterije replicirajo med celično delitvijo in konjugacijo. Lahko so mobilne, mobilizabilne ali nemobilne. Mobilni plazmidi nosijo gene za replikacijo, začetek prenosa in mehanizme, medtem ko mobilizabilni nosijo gene samo za replikacijo in začetek prenosa. Obe vrsti omogočata gensko izmenjavo in pogosto prenašata dejavnike virulence in gene za odpornost proti antibiotikom.

Bakterijska konjugacija plazmidov in človeško črevo

Čeprav so neposredni poskusi na ljudeh etično zahtevni, številne opazovalne študije poudarjajo vpletenost človeške mikrobiote v plazmidno posredovan horizontalni prenos genov (HGT) protimikrobne odpornosti (AR) in genov virulence (VG). S plazmidi posredovani AR in VG so dobro dokumentirani v kliničnih vzorcih in so povezani s pojavom odpornih bakterijskih sevov v zdravstvenih ustanovah. Čeprav so bile predlagane hipotetične interakcije med gostiteljem in mikroorganizmi (HMI), jih je bilo le malo eksperimentalno dokazanih in vivo. Črevesna mikrobiota je v tem kontekstu ključna zaradi svojega pomena, številčnosti in vpliva na biologijo gostitelja. Za preučevanje teh interakcij so raziskovalci predlagali modele in vitro in in vivo. Integrativni in konjugativni elementi skupaj z naravno transformacijo lahko prispevajo k prenosu genov v črevesju, vendar njihova posebna vloga in prispevek k protimikrobni odpornosti in širjenju virulence ostajajo nejasni.

Modeli in Silico

Bakterijska konjugacija plazmidov je zapletena, saj vključuje regulacijo DNK in beljakovin, signalizacijo in interakcije. Matematični modeli pomagajo razumeti te zapletenosti, saj vključujejo dejavnike, kot sta bakterijska rast in stabilizacija beljakovin. Tepekule in drugi so z uporabo diferencialnih enačb povezali zgodovino zdravljenja z antibiotiki z razvojem odpornosti. Ugotovili so tri ključne dejavnike: skupno izpostavljenost zdravilu, trajanje okrevanja in vzorec zdravljenja. Klümper in drugi so z in vitro in matematičnimi modeli preučevali prenos plazmidov v kompleksnem okolju mikrobiote ter predlagali mehanizme za zmanjšanje odpornosti. Vendar ima matematično modeliranje omejitve zaradi kakovosti in raznolikosti podatkov.

Modeli in Vitro

Namen študij in vitro je posnemanje črevesnih pogojev za teste konjugacije. Metode vključujejo konjugacije v raztopini in na trdni površini. V raztopini se združita seva dajalca in prejemnika v mediju, nato pa se selektivno razmnožita. Trdna površina vključuje gojenje sevov na agarju ali filtrirnem papirju, čemur sledi ustvarjanje suspenzije in nanos. Obe metodi posnemata različna črevesna okolja, vendar ne predstavljata v celoti črevesnih razmer. Dejavniki, kot so pH, slanost in gostiteljska mikrobiota, vplivajo na konjugacijo in pojav odpornih sevov.

Kemostatski modeli

Kemostati simulirajo črevesno okolje z uravnavanjem pH, osmolarnosti in hranil. Omogočajo vpogled v interakcije med bakterijami, vendar ne posnemajo v celoti zapletenosti črevesja. Študije kažejo na prenos plazmidov v simuliranih črevesnih okoljih, vendar pa kemostati nimajo lokaliziranih pogojev črevesja.

Modeli Ex Vivo

V preprostih študijah in vitro manjkajo pomembni dejavniki gostitelja, zato je treba poiskati vmesne pogoje, ki bi uravnotežili preprostost z določeno kompleksnostjo gostiteljskih okolij. Eden od običajnih pristopov je uporaba gostiteljskega tkiva ex vivo, ki ponuja nadzorovane pogoje z večjo kompleksnostjo v primerjavi s tradicionalnimi testi in vitro.

Model celične kulture

Preučevanje prenosa plazmidov v človeškem črevesju je zahtevno, vendar uporaba celičnih linij prebavil, kot je Caco-2, omogoča vpogled v interakcije med gostiteljem in mikroorganizmi. Machado in drugi so uporabili celice Caco-2 za posnemanje črevesnega okolja in prikazali bakterijsko konjugacijo. Odkrili so proteinski dejavnik, ki vpliva na konjugacijo, vendar ga še niso v celoti identificirali. Čeprav ta model nima elementov, kot sta sluznična pregrada in imunska funkcija, omogoča podrobne študije z dodajanjem specifičnih dejavnikov. Celična kultura pomaga pri razumevanju interakcij med bakterijami, vendar ne replicira v celoti zdravega črevesnega tkiva.

In Vivo

Čeprav in vitro modeli ponujajo vpogled v določene vidike bakterijskega prenosa v črevesnem okolju, so živalski modeli bolj zanesljivi, saj vključujejo še druge dejavnike, kot so imunost, prehrana, genetika in črevesni mikrobiom.

Antropodi

Artropodi so v stiku z mikrobi v okolju, kar vpliva na horizontalni prenos genetskih informacij bakterij. Vloga tega pri odpornosti na antibiotike ni dobro poznana. Artropodni mikrobiot, kot je Folsomia candida, pomembno širi genetski material, kar vpliva na odpornost bakterij na antibiotike na pridelkih. Eksperimentalne študije interakcij med bakterijami in artropodi so redke, vendar so modeli, kot je Drosophila melanogaster, obetavni za razumevanje mehanizmov konjugacije v črevesju. Potrebne so nadaljnje raziskave za razumevanje vpliva artropodnega mikrobiota na razvoj patogenih bakterij, kar lahko vpliva tudi na človeka.

Črvi

Caenorhabditis elegans, majhen črv, je široko uporabljen pri študijah genetike in razvoja celic, ker je enostaven za delo. Hitro razmnoževanje in enostavna nega omogočata preučevanje njegovega vpliva na bakterije. Raziskovalci so pokazali, da lahko ta prenaša določen genski material med bakterijami v svojem črevesju. Ugotovili so, da tako starost kot genetika vplivata na to, koliko se to dogaja. Vendar pa je tu težava: način, kako so opravili študijo, pušča prostor za dvome. Črvi so bili gojeni na bakterijah, in možno je, da je bil genski material prenesen zunaj telesa črva in nato zaužit. To bi lahko vplivalo na rezultate, zato morajo najti boljši način za raziskovanje, da bi bili prepričani, da se dogaja znotraj črevesja črva.

Ptiči

Mikrobni kontaminanti na perutninskih vzorcih so povezani z bakterijskimi okužbami sečil pri ljudeh. Kokoši so pomemben gostitelj prehranskih bolezni, zato industrija skrbi za razvoj odpornosti na antibiotike. Študije na piščančjih črevesjih so pomembne za razumevanje prenosa bakterijskih plazmidov. Horizontalni prenos genetskega materiala med bakterijami je vir odpornosti na antibiotike in širjenja virulentnih dejavnikov. Črevesna RNA je ključna pri prenosu plazmidov, kar zahteva nadaljnje raziskave.

Zajci

Zajci so dragocen eksperimentalni model za raziskave na ljudeh in drugih živalih, čeprav imajo fiziološke razlike, kot je prebava. Uporabljajo se za študije različnih okužb in bolezni, kot je endokarditis E. faecalis. Nekatere raziskave kažejo, da lahko kri človeka in zajca spodbuja prenos plazmidov. Pomembnost tega dela je razmišljanje o metodah za preprečevanje prenosa plazmidov. Razumevanje imunskega odziva na plazmide morda ni dovolj za preprečevanje horizontalnega prenosa genov, lahko ga celo poslabša z motenjem normalne regulacije konjugacije.

Sesalci

Opazovanje prenosa plazmidov preko konjugacije v črevesju sesalcev je kompleksno zaradi raznolikosti gostiteljskih dejavnikov, kot so prehrana, okolje, starost, genetika in mikrobiota. Čeprav so mišji modeli koristni, sesalci, vključno z ljudmi, imajo lastnosti, ki otežujejo raziskave. Naravna odpornost miši proti nekaterim bakterijam zahteva prilagoditve, kot je uporaba antibiotikov, kar lahko povzroči dodatne učinke, na primer spremenjeno funkcijo črevesja in vnetje. Druga možnost je uporaba sesalcev brez mikroorganizmov, vendar to prav tako prinaša izzive. Uničenje naravne črevesne mikrobiote lahko vpliva na normalno fiziologijo gostitelja in homeostazo črevesja, kar lahko povzroči dodatne učinke, kot so spremenjena funkcija črevesja, driska, vnetje in zmanjšana absorpcija hranil. Ti dejavniki otežujejo raziskave ali pa dodajo spremenljivke, ki jih je treba upoštevati. Nadaljnje raziskave so ključne za boljše razumevanje in premagovanje izzivov pri uporabi sesalskih modelov za študije prenosa plazmidov v črevesju.

Zaključek

Preučevanje horizontalnega prenosa genov v črevesju ljudi in živali je ključno za obvladovanje nastanka in širjenja odpornih in virulentnih plazmidov. In vitro modeli so omejeni, saj ne reproducirajo kompleksnosti črevesnega okolja. ASF model omogoča kontrolirano simulacijo človeškega črevesja, vendar se še premalo uporablja za preučevanje faktorjev, ki vplivajo na prenos genov. Dodatni modeli, kot je model za členonožce, bi lahko razkrili nove poti za preprečevanje nastanka odpornosti in virulentnosti v črevesju.

Viri

1. Klümper, U., Recker, M., Zhang, L., Yin, X., Zhang, T., Buckling, A., & Gaze, W. H. (2019). Selection for antimicrobial resistance is reduced when embedded in a natural microbial community. ISME Journal, 13(12), 2927–2937. https://doi.org/10.1038/s41396-019-0483-z

2. Ott, L. C., & Mellata, M. (2022). Models for Gut-Mediated Horizontal Gene Transfer by Bacterial Plasmid Conjugation. In Frontiers in Microbiology (Vol. 13). Frontiers Media S.A. https://doi.org/10.3389/fmicb.2022.891548

3. Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P. C., & de la Cruz, F. (2010). Mobility of Plasmids. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 74(3), 434–452. https://doi.org/10.1128/mmbr.00020-10