Modeliranje sintetične večcelične ure: Represilatorji, sklopljeni z zaznavanjem celične gostote
Modeling a synthetic multicellular clock: Repressilators coupled by quorum sensing
V živih organizmih je mnogo fizioloških procesov podvrženih intrinzičnim biokemijskim ritmom, ki jih vodijo biološke ure. Te delujejo prek kompleksnih biokemijskih omrežij, ki so regulirana s povratnimi zankami in vplivajo na izražanje genov. Biološke ure najdemo tako pri visoko razvitih organizmih kot pri preprostejših enoceličnih organizmih. Najpreprostejša znana biološka ura je cirkadiana ura, ki sestoji iz omrežja treh genov in jo najdemo pri nekaterih cianobakterijah iz rodu Synechococcus. Sesalci imajo znotraj telesa več specializiranih bioloških ur, ki uravnavajo delovanje posameznih organov oziroma kar celotnega organizma. Najbolj znana primera sta srčni ritmovnik, ki uravnava bitje srca, in cirkadiana ura v možganih, ki skrbi za dnevno-nočni ritem. Tako pri enoceličarjih kot pri večceličnih organizmih ima vsaka celica svojo lastno molekularno uro. Kljub temu, da se lahko te med seboj rahlo razlikujejo, se sistem navzven obnaša usklajeno kot ena sama velika biološka ura, kar celice dosežejo z različnimi načini sinhronizacije.
V dobi sintezne biologije so raziskovalci ustvarili umetne biološke ure, ki jih ne najdemo nikjer v naravi, tako imenovane oscilatorje. Prvi sinteznobiološki oscilator je Elowitzev represilator, ki deluje v E. coli. Ta umetni biološki oscilator sestoji iz omrežja treh transkripcijskih represorjev, ki ciklično inhibirajo izražanje eden drugega. Z represilatorjem sta Elowitz in Leibler dosegla, da so posamezne celice oscilirajoče izražale zeleni fluorescenčni protein, vendar med sabo niso bile usklajene. Eden izmed možnih načinov za sinhronizacijo represilatorjev v populaciji je povezava oscilatorja z zaznavanjem celične gostote, kar so računalniško modelirali avtorji članka Modeling a synthetic multicellular clock: Repressilators coupled by quorum sensing.
Večcelična sintetična ura
Represilator
Represilator sestoji iz sistema treh represorjev LacI, TetR in λ cI. Prvi represor LacI zavira izražanje drugega represorja TetR, ta zavira izražanje tretjega represorja λ cI, ki zavira izražanje prvega represorja LacI, s čimer sklene krog. Pogoji, da se sistem res obnaša kot oscilator, so močni promotorji z učinkovito represijo (zelo majhno puščanje promotorja ob prisotnosti ustreznega represorja) in primerljiva življenjska doba mRNA ter proteinov. V ta namen so uporabili močne hibridne promotorje na osnovi promotorja λ PL z ustreznim operatorskim mestom za vezavo represorja LacI oziroma TetR in lite različice represorjev, ki imajo na C-koncu oznako za razgradnjo, kar ustrezno skrajša njihovo življensko dobo. Za spremljanje oscilacije morajo celice vsebovati še reporterski plazmid z zapisom za zeleni fluorescenčni protein s krajšo življenjsko dobo pod kontrolo promotorja PLtetO1, na katerega deluje represor TetR.
Računalniško modeliranje oscilacije temelji na predpostavki, da imajo vsi represorji enake lastnosti (moč promotorja, učinkovitost represije, učinkovitost translacije, itd.). Kinetiko sistema je mogoče opisati s šestimi diferencialnimi enačbami, kjer kot spremenljivke nastopajo koncentracije vseh treh represorskih proteinov in ustreznih mRNA, nanje pa vplivajo transkripcija, translacija ter razgradnja. Pri tem ima pomembno vlogo razmerje med življenjsko dobo proteina in mRNA, saj ima to največji vpliv na periodo oscilacije.
Največja slabost represilatorja je, da njegovo osciliranje ni usklajeno med bakterijami, zato ni bilo mogoče meriti fluorescence v celotni populaciji, ampak je bilo potrebno pod mikroskopom spremljati spreminjanje fluorescence za vsako celico posebej. Poskus sinhronizacije oscilatorjev znotraj populacije z IPTG ni bil uspešen, saj celice nimajo sistema, ki bi sinhronizacijo lahko ohranjal. Dodatna slabost je velik šum, saj se dolžina periode zaradi stohastičnih efektov in variabilnosti števila kopij plazmida razlikuje med celicami v populaciji.
Sistem za zaznavanje celične gostote (quorum sensing) izvira iz bakterije Vibrio fischeri in predstavlja način komunikacije med celicami, ki deluje tudi v E. coli. Zaznavanje celične gostote temelji na dveh proteinih: prvi je LuxI, ki sintetizira majhno molekulo acilhomoserinlakton (AHL). Ta je sposobna proste difuzije prek celične membrane in deluje kot avtoinduktor (AI). Ta se lahko veže na drugi protein imenovan LuxR, ki lahko posledično aktivira izražanje drugih genov.
Tak sistem bi lahko pripomogel k sinhronizaciji represilatorja v populaciji, saj bi vsaka celica lahko sporočila ostalim, v kateri fazi oscilacije je, in pripomogla k ponastavitvi represilatorjev v populaciji. V celico z že obstoječim represilatorjem bi dodali gen LuxI pod kontrolo represorja LacI in dodatno kopijo gena za LacI pod kontrolo kompleksa LuxR-AI. Tako bi se v celici ob pomanjkanju represorja LacI sintetiziral AI, ki bi difundiral iz celic in v celotni populaciji sprožil sintezo LacI ter s tem represilator postavil na začetek cikla.
Kinetiko takšnega modela je možno modelirati podobno kot sam represilator: z diferencialnimi enačbami, ki opišejo spreminjanje koncentracij represorskih proteinov in njihovih mRNA. Pri tem pa je potrebno upoštevati, da se v tem primeru v celici nahaja še dodatna kopija gena za represor LacI, torej je koncentracija mRNA neposredno odvisna tudi od znotrajcelične koncentracije AI. Na koncentracijo AI znotraj celice pa vplivajo njegova razgradnja, sinteza in difuzija prek celične stene. Pri hitrosti sinteze avtoinduktorske molekule je potrebno predpostaviti, da je razpolovna doba proteina LuxI enaka kot za represorski protein TetR in je torej hitrost sinteze AI sorazmerna koncentraciji TetR. Hitrost difuzije AI prek celične membrane je odvisna od permeabilnosti membrane, površine in volumna celice ter razliki med koncentracijama AI znotraj in zunaj celice. Zunajcelična koncentracija AI je odvisna od številnih dejavnikov, vendar pri dovolj veliki celični gostoti velja približek iz modela zaznavanja celične gostote. Ta predpostavlja, da je koncentracija AI enaka po celi kulturi ter je sorazmerna celični gostoti in povprečni količini AI, ki ga sintetizira celica.
Sinhronizacija represilatorjev v populaciji celic
V populaciji celic z represilatorji so lahko med njimi precejšnje razlike. Na to najbolj vpliva razmerje življenjskih časov proteinov in mRNA (parameter β), ki je v idealnem primeru enako β=1. V populaciji torej obstaja normalna porazdelitev frekvenc oscilatorjev.
Sinhronizacijo represilatorjev naj bi celice z zaznavanjem celične gostote dosegle relativno hitro, že v nekaj ciklih oscilatorja. S tem, ko se poveča gostota celic, se poveča tudi koncentracija AI, kar prisili represilatorje, da se sinhronizirajo. Takrat se sistem začne obnašati kot makroskopski oscilator z dobro definirano periodo. Sinhronizacijo je možno kvantitativno opisati s parametrom R, katerega vrednost je lahko med 0 in 1. Pri nesinhroniziranih oscilatorjih se R približa vrednosti 0, pri popolni sinhronizaciji pa je enak 1.
Zmožnost sinhronizacije represilatorjev je odvisna tudi od tega, koliko so si podobni med sabo. Matematični model, ki opisuje represilator, predpostavlja, da imajo vsi trije represorji LacI, TetR in λ cI ter njihovi geni enake lastnosti, kar pa v resnici ne drži popolnoma. Bolj kot so si represilatorji podobni, lažje pride do sinhronizacije, pri velikih razlikah med njimi pa se sinhronizacija izgubi.
Do razlik v oscilaciji lahko prihaja tudi pri vsaki posamezni celici, kar povzroča šum. S povečanjem celične gostote in sinhronizacijo se zmanjša tudi šum, kar na splošno vodi do izboljšanja zanesljivosti sintetične biološke ure.
Zaključek
Neusklajenost osciliranja represilatorjev med posameznimi celicami je tako velika, da oscilacij ni mogoče spremljati z merjenjem fluorescence celotne populacije. Kot rešitev tega problema so avtorji članka Modeling a synthetic multicellular clock: Repressilators coupled by quorum sensing predlagali, da bi lahko v celice z že obstoječim represilatorjem dodali modul za zaznavanje celične gostote, in z računalniškim modeliranjem pokazali, kako bi tak sistem sinhroniziral sicer neusklajene represilatorje v populaciji celic. Njihov model predpostavlja, da komponente represilatorja predstavljajo idealen sistem, kjer imajo vsi trije represorji in njihovi geni enake lastnosti, vendar pa naj bi sinhronizacija delovala tudi v realnih primerih, kjer taka predpostavka ne drži. Poleg same sinhronizacije, naj bi povezava represilatorja z zaznavanjem celične gostote tudi zmanjšala šum v sistemu, kar bi vodilo do tega, da bi taka populacija celic postala zanesljiv makroskopski oscilator. V naravi, kjer so načini sinhronizacije bioloških ur sicer zelo raznoliki, tak način, ki temelji na difuziji neke male molekule, ni pogost. Temu mehanizmu se še najbolj približajo oscilacije glikolize pri kvasovkah, kjer se njihov metabolizem uskladi z difuzijo acetaldehida.
Viri
- GARCIA-OJALVO, Jordi, ELOWITZ, Michael B in STROGATZ, Steven H. Modeling a synthetic multicellular clock: repressilators coupled by quorum sensing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 27 julij 2004. Vol. 101, no. 30, p. 10955–60.
- ELOWITZ, Michael B in LEIBLER, Stanislas. A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators. Nature. 20 januar 2000. Vol. 403, no. 6767, p. 335–338.
