Modularen RNA interferenčni sistem za regulacijo multipleksnih genov
Uvod
Cilj sintezne biologije je narediti inženiring bioloških sistemov bolj predvidljiv, učinkovit in zanesljiv. Doseganje tega cilja je pogojeno z uporabo standardov in genetskih komponent, ki jih je mogoče na predvidljiv način združiti v funkcionalne biološke sisteme na višjem nivoju [1]. Za pripravo vedno bolj kompleksnih in hkrati zanesljivih bioloških sistemov je pomembno, da imamo na voljo genetske komponente, ki so dobro okarakterizirane in delujejo predvidljivo v vsakem sistemu, v katerem jih uporabljamo. Za razširitev zbirke orodij modularnih biomolekularnih elementov, so Ari Dwijayanti, Marko Storch, Guy-Bart Stan in Geoff S. Baldwin v raziskavi pripravili in okarakterizirali kontrolne elemente, ki učinkujejo na post-transkripcijskem nivoju, in sicer male nekodirajoče RNA (sRNA) [2]. sRNA so kratke nekodirajoče RNA pri prokariontih, ki preko prehodnih RNA-RNA interakcij nadzorujejo ekspresijo genov. Njihovo zaporedje je obratno komplementarno tarčnemu. Glede na lokacijo zapisa za sRNA in njihovega tarčnega zaporedja poznamo cis- in trans-zapisane sRNA. Cis-zapisane sRNA se nahajajo na istem lokusu kot je zapisano zaporedje za njihovo tarčo, trans-zapisane pa na distalnem mestu glede na zapis za njihovo tarčno zaporedje, kljub temu pa lahko trans-zapisane sRNA učinkovito regulirajo njihove mRNA tarče. V bakterijskih sistemih so ravno trans-zapisane sRNA bile prepoznane kot bolj efektivne pri utišanju ekspresije genov, kar pripisujejo njihovi daljši razpolovni dobi v citoplazmi. Ta je najverjetneje posledica vezave trans-zapisanih sRNA na Hfq šaperone [3]. sRNA so sestavljene iz dveh delov in sicer ogrodja (ang. scaffold), ki prepozna in veže Hfq in semenskega dela, ki prepozna tarčno mRNA zaporedje (ang. seed sequence). Zaradi svoje sestavljene strukture, se lahko sRNA reprogramira, tako da cilja katerokoli zaporedje RNA s spremembo semenskega zaporedja, pri čemer zaporedje ogrodja ostane nativno. Za uporabo sRNA v genetskih vezjih pripravljenih z modularnimi metodami sestavljanja DNA, so A. Dwijayanti in sodelavci pripravili konstrukte sRNA imenovane mARi (modular artificial RNA interference), ki ciljajo standardizirana povezovalna zaporedja navzgor od tarčnega gena, ki se uporabljajo pri BASIC načinu priprave DNA vezij oziroma bioloških sistemov. BASIC je metoda sestavljanja DNA, ki temelji na rezanju z restrikcijskimi endonukleazami tipa IIs (RE BsaI) in ligaciji oligonukleotidov z enoverižnimi previsi, ki določajo red povezovanja biodelov. Uporablja povezovalna zaporedja (ang. linker) za sestavljanje biodelov shranjenih v BASIC formatu [1]. Standardna povezovalna zaporedja lahko že vsebujejo tudi določene 5' neprevajajoče se regije (5'-UTR) in mesta za vezavo ribosoma (RBS) [4]. Sledila je karakterizacija post-transkripcijske regulacije na osnovi mARi v kontekstu raznih genetskih parametrov kot so razmerje transkripta, število kopij molekul, prostorska organizacija in drugi.
Rezultati
Načrtovanje regulacijskega sistema na osnovi mARi
Načrtovana mARi zaporedja so ciljala regijo iniciacije translacije na mRNA iz treh razlogov: 1) 5' UTR zaporedja so relativno bogata z AU in Hfq preferenčno veže ravno taka zaporedja, 2) tarče, ki se nahajajo v tej regiji, so kazale visoko specifičnost in majhen netarčni efekt v primeru sRNA regulacije, 3) ta regija je neodvisna od gena, ki mu sledi in tako predstavlja potencialno tarčo za modularnost preko UTR-RBS povezovalnih zaporedij v BASIC sistemu Preko izražanja proteina GFP in merjenja fluorescence so preverili 4 različna zaporedja, ki so ciljala različna tarčna zaporedja na mRNA, katerim so bila popolno komplementarna. Vsa preverjana zaporedja so bila povezana z MicC RNA ogrodjem, ki se naravno nahaja v E. coli. Vsa zaporedja so v primerjavi s kontrolami pokazala učinkovito regulacijo oziroma represijo ekspresije GFP. Za nadaljnje poskuse so izbrali zaporedje, ki je ciljalo UTR regijo navzgor od mesta RBS in so ga dodatno optimizirali s skrajšanjem dolžine iz 33 bp na 25 bp. Z uporabo različnih zaporedij RBS so tudi preverili neodvisnost delovanja izbranega mARi zaporedja od jakosti mesta RBS in jo tudi dokazali, saj je bila relativna represija izražanja GFP približno enaka pri vseh različnih uporabljenih mestih RBS.
Odvisnost od razmerja transkriptov in števila kopij plazmida
Vpliv relativnega obilja mARi v primerjavi s tarčno mRNA (transkript gena za sfGFP) so preverjali s konstitutivnim izražanjem obeh transkriptov. Relativno obilje so ocenili preko relativne moči promotorja uporabljenega za transkripcijo regulatorja in tarče. Uporabili so različno močne konstitutive promotorje PJ23xxx BASIC. Relativno razmerje ekspresije transkriptov so določili z deljenjem jakosti promotorja uporabljenega za mARi z jakostjo promotorja mRNA tarče. Rezultati so pokazali konsistenten trend padanja fluorescence sfGFP z naraščanjem razmerja mARi:mRNA. Maksimalna represija je bila dosežena, ko je bila prisotna prekomerna količina mARi v primerjavi s tarčno mRNA, nizko razmerje pa je vodilo do slabe represije, kar je najverjetneje posledica premajhnega števila kopij mARi za vezavo in inaktivacijo tarčne mRNA. Znanstvenike je zanimalo tudi, kako različno število kopij plazmida vpliva na učinkovitost represije z mARi in sicer tako v primeru, ko sta regulator in tarča zapisana na enem plazmidu in ko sta zapisana na dveh različnih plazmidih. V primeru enega plazmida, so oba zapisa vnesli v tri plazmide, ki se običajno v celicah nahajajo v različnih številih: pSC101 (∼5 kopij na celico), p15A (∼10 kopij na celico) in pMB1 (∼15–20 kopij na celico). V vseh primerih je prišlo do represije ekspresije sfGFP tako v visokem kot v nizkem razmerju mARi:mRNA, kar dokazuje, da je regulatorni sistem na osnovi mARi učinkovit pri različnih številih kopij plazmida. V primeru dveh plazmidov, so mARi vnesli v vektor z višjim številom kopij na celico v primerjavi z vektorjem, ki je vseboval tarčno mRNA saj so predvidevali, da bo tako represija uspešnejša. Za transkripcijo mARi so uporabili vektorja pMB1 in pUC (∼500–700 kopij na celico), za tarčno mRNA pa vektor p15A. Kljub temu, da je bil mARi zapisan na plazmidu z višjim številom kopij, je v obeh primerih dvoplazmidni sistem kazal slabšo represijo kot enoplazmidni sistem z obema zapisoma na plazmidu p15A. To kaže na morebitno vlogo prostorske organizacije transkriptov in posledične post-transkripcijske represije.
Učinkovitost sistema na osnovi mARi v različnih sevih E. coli
Za primerjavo učinkovitosti represije v različnih genetskih kontekstih so preverjali utiševalno sposobnost v štirih pogosto uporabljanih sevih E. coli: DH5, DH10b, BL21(DE3) in BL21star(DE3). Pri tem so uporabljali enovektorski sistem na plazmidu p15A. Pri genetski regulaciji sodelujejo šaperon Hfq in degradosomski kompleks, ki sta v teh sevih naravno prisotna, količina teh komponent sistema pa je odvisna od različnih dejavnikov kot sta genotip in faza rasti celic. V zgodnji stacionarni fazi rasti je v vseh sevih prišlo do 60 – 80% represije, pri čemer je do večje represije prišlo v sevih B pri primerljivih številih plazmidov na celico. Prav tako je bil sistem aktiven v različnih fazah rasti s tem, da je pri sevih B v zgodnji stacionarni fazi bila represija nekoliko bolj učinkovita kot v eksponentni fazi rasti.
Povečevanje števila mARi regulatorjev za represijo več genov hkrati
Za represijo več genov hkrati so v tej študiji pripravili pet različnih mARi zaporedij, ki so ciljala različna standardna UTR-RBS povezovalna zaporedja v sklopu BASIC. S kombiniranjem vseh mARi regulatorjev z vsemi tarčnimi UTR, so preverili specifičnost delovanja mARi. Ugotovili so, da je vsak določen mARi deloval samo na željeno tarčno zaporedje UTR. Do te točke so vse parametre preučevali le preko ekspresije enega gena hkrati. Po dokazu specifičnosti delovanja posameznih mARi pa so želeli oceniti še učinkovitost in specifičnost delovanja tega sistema na več genov hkrati. Pripravili so konstrukte z dvema oziroma tremi reporterskimi geni, ki so bili zapisani kot posamezne transkripcijske enote. Vsak posamezen gen je imel navzgor v povezovalnem zaporedju zapisano specifično UTR-RBS regijo. Po zaznavanju fluorescence so ugotovili, da je bil vsak gen uspešno reguliran s samo enim mARi. Ker pa jih je zanimalo tudi, kako se ta sistem obnese v kontekstu dvo-genskih operonov, so pripravili konstrukt z dvema reporterskima genoma (vsak s svojo specifično UTR-RBS regijo) na eni transkripcijski enoti. Ta poskus je omogočil tudi vpogled v delovanje sistema z uporabo mARi. V primeru, da bi vezava mARi na tarčno mRNA vodila v razgradnjo kompleksa, bi vsak posamezen mARi vodil v utišanje obeh genov v operonu. Ker pa je uporaba posameznega mARi vodila le v povečano utišanje gena s sorodnim UTR-RBS zaporedjem in v manj močno utišanje drugega gena, lahko sklepamo, da je princip delovanja sistema sterično oviranje vezave ribosoma na RBS.
Zaključek
V tem delu opisani sistem inhibicije z uporabo malih RNA zaporedij mARi predstavlja zanimivo metodo za regulacijo izražanja genov v sinteznih vezjih pripravljenih po postopku BASIC. Ta sistem je specifičen tako za uporabo pri regulaciji enega gena kot tudi pri regulaciji več genov na enkrat. Potencialna ovira tega sistema je deljena uporaba endogenega šaperona Hfq, ki je reguliran tudi z vezavo lastne mRNA. Odstopanja od optimalne koncentracije Hfq v celici pa lahko vodijo do zmanjšane aktivnosti sRNA.
Literatura
[1] M. Storch, A. Casini, B. Mackrow, T. Fleming, H. Trewhitt, T. Ellis, G. S. Baldwin: BASIC: A New Biopart Assembly Standard for Idempotent Cloning Provides Accurate, Single-Tier DNA Assembly for Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 2015, 4(7), str. 781–787.
[2] A. Dwijayanti, M. Storch, G. B. Stan, G. S. Baldwin: A modular RNA interference system for multiplexed gene regulation. Nucleic Acids Res. 2022, 50(3), str. 1783–1793.
[3] M. J. Ellis, R. S. Trussler, D. B. Haniford: A cis-encoded sRNA, Hfq and mRNA secondary structure act independently to suppress IS200 transposition. Nucleic Acids Res. 2015, 43(13), str. 6511.
[4] Home | BASIC https://www.basic-assembly.org/ (pridobljeno 2. 5. 2022).
