Modularna optimizacija več genskih poti za proizvodnjo maščobnih kislin v E. coli
Uvod
Vedno večje svetovno povpraševanje po energiji, naraščajoče cene nafte in skrb za okolje so bili povod za razvoj proizvodnje obnovljivih goriv, ki bi nadomestila tradicionalno uporabljena fosilna goriva. Eden izmed načinov za proizvodnjo le-teh temelji na klasičnem metaboličnem inženiringu, izboljšanem s principi sintezne biologije. Kombinacija obeh pristopov predstavlja obetavno rešitev za sintezo »drop-in« transportnih goriv s pomočjo mikroorganizmov.
Med vsemi do sedaj proizvedenimi molekulami goriva s pomočjo živih organizmov, imajo maščobne kisline (MK) in njihovi derivati največjo volumetrično energijsko gostoto, saj je večina ogljikov v njihovih dolgih verigah v reduciranem stanju (njihova oksidacija da tako največ energije). Njihove fizikalno-kemijske lastnosti so zelo podobne gorivom na osnovi nafte, poleg tega pa ponujajo tudi kar nekaj edinstvenih prednosti v primerjavi z drugimi alternativnimi biogorivi. V primerjavi z etanolom in n-butanolom se maščobne kisline dobro mešajo z dizelskimi gorivi, so manj higroskopne, njihovi stroški čiščenja so nižji, velika prednost pa je tudi kompatibilnost z že obstoječo infrastrukturo (tako imenovana »drop in« goriva).
Problem sicer nastopi pri načrtovanju sevov E. coli s povišano proizvodnjo MK, saj je običajno za to potrebna manipulacija prekurzorjev ali celičnih poti, ki so podvržene tesni celični regulaciji. Kopičenje ali primanjkljaj določenih intermediatov pa lahko ogrozi preživetje celic in njihovo produktivnost. Z različnimi pristopi in manipulacijami metaboličnih poti je znanstvenikom do sedaj uspelo pridobiti različne količine MK in njihovih derivatov v E. coli in ostalih mikroorganizmih. Kljub vsem dosedanjim dosežkom pa se morajo še vedno razviti ekonomsko izvedljivi postopki pridobivanja MK z visokimi donosi in višjo produktivnostjo (2).
Zasnova biosinteznih poti maščobnih kislin v E. coli
Pogosta strategija metaboličnega inženiringa za izboljšanje donosa je prekomerno izražanje encimov, ki predstavljajo ozka grla v biosintezni poti in s tem povečanje pretoka ogljika proti želeni smeri produkta.
V začetnih poskusih povečanja proizvodnje maščobnih kislin v E. coli so iz genoma odstranili maščobno acil-CoA sintetazo (fadD) s protokolom kromosomske genske inaktivacije na osnovi lambda rdeče rekombinaze iz lambda rdečega bakteriofaga (3), z namenom, da bi blokirali pot razgradnje maščobnih kislin in zmanjšali alosterično inhibicijo acetil-CoA karboksilaze z nakopičenimi maščobnimi acil-CoA. Tako načrtovan sev je proizvedel le za odtenek več MK, zato so sklepali, da imajo na hitrost sinteze MK večji vpliv drugi dejavniki. S povečanjem ekspresije vseh štirih podenot acetil-CoA karboksilaze (ACC, ki jo kodira accABCD) iz E. coli, so pospešili pretok ogljika proti nastajanju prekurzorja malonil-CoA in dobili spremenjen sev, ki je proizvedel 3x več MK. Naslednji korak izboljšanja proizvodnje MK v E. coli pa je bila še citosolna ekspresija nativne maščobne acil-ACP tioesteraze (tesA') in treh različnih rastlinskih maščobnih acil-ACP tioesteraz. Z ekspresijo slednjih so zmanjšali povratno inhibicijo β-ketoacil-ACP sintetaze (fabB ali fabH) z nakopičenimi molekulami maščobnih acil-ACP. Škodljive maščobne acil-ACP intermediate so s tem namreč pretvorili v maščobne kisline in tako zaključili cikel podaljševanja verig.
Z ekspresijo skrajšane oblike tesA', se je proizvodnja maščobnih kislin povečala za 90% v primerjavi z WT sevom, z ekspresijo 3 različnih kodonsko optimiziranih rastlinskih ACP tioesteraz (BnFatA, CnFatB2 in EgTE) pa so ugotovili, da je med vsemi CnFatB2 najbolj učinkovita v primeru povečanja proizvodnje MK v E. coli, pa čeprav le na zmerni ravni. Ob ekspresiji različnih maščobnih acil-ACP tioesteraz, pa se je drastično spremenila tudi dolžina in maščobno-kislinska sestava. V skladu s prejšnjimi študijami so maščobne acil-ACP tioesteraze odločilne za dolžino verig in level nasičenosti proizvedenih MK tako v rastlinah kot tudi v E. coli.
V prejšnjih raziskavah so na podlagi omejitev in s pomočjo nedavno razvitega računalniškega programa OptForce identificirali tarčne gene, katerih povečana ekspresija oziroma delecija je na koncu vodila do 4x povečanja levelov celičnega acetil-CoA in malonil-CoA (4). Tarče so vključevale povečano ekspresijo encimov glikolitične poti, kot so gliceralaldehid-3-fosfat dehidrogenaza (gapA), fosfoglicerat kinaza (pgk) in piruvat dehidrogenazni več encimski kompleks (aceEF in lpdA) skupaj z ekspresijo ACC poti. Poleg že omenjenih tarčnih genov so ugotovili, da več encimski kompleks sinteze maščobnih kislin v E. coli, kodiran z fabA, fabD, fabG in fabI, tudi vpliva na povečanje proizvodnje MK. Geni, ki kodirajo encime glikolitične kot tudi sintezne poti maščobnih kislin (fabADGI), so bili zbrani na plazmidu z visokim številom kopij in na plazmidu z nizkim številom kopij. Povečana ekspresija posebej encimov glikolitične poti ali encimov biosintezne poti maščobnih kislin je izboljšala proizvodne titre MK v obeh tesA' in CnFatB2 ekspresijskih sevih. Sočasna ekspresija encimov obeh poti pa je vodila do manj optimalnega fenotipa proizvodnje MK, kar nakazuje na presnovno neravnovesje med oskrbo z acetil-CoA in porabo malonil-CoA. Intermediati metaboličnih poti so v večjih koncentracijah za celice lahko toksični, zato morajo biti koncentracije encimov usklajene, da se intermediati ne akumulirajo do toksičnih ravni, ki bi bile škodljive za samo rast celic.
Modularna optimizacija poti za izboljšanje proizvodnje maščobnih kislin
V članku opisujejo uvedbo modularnih poti in strategij za optimizacijo več genskih poti potrebnih za proizvodnjo presežnih količin MK v E. coli. Na podlagi prejšnjih raziskav so izbrali 15 ključnih genov in jih razdelili tako, da so biosintezno pot maščobnih kislin razčlenili na 3 posamezne module in jih vstavili v ePathBrick kompatibilne vektorje (5). V procesu modularne optimizacije so poiskali in odpravili tudi ozka grla metaboličnih poti tako na transkripcijski, kot translacijski ravni.
- GLY modul (kodiran z pgk, gapA, aceE, aceF in lpdA) predstavlja model glikolize in končno pretvorbo glukoze do acetil-CoA
- ACA povezovalni modul (kodiran z fabD, accA, accB, accC in accD) predstavlja aktivacijo acetil-CoA in njegovo pretvorbo do malonil-ACP, katerega lahko uporabi FAS modul
- FAS modul (kodiran z CnfatB2, fabA, fabH, fabG in fabI) je zadolžen za biosintezo maščobnih kislin s postopki iniciacije, elongacije in terminacije verig MK na podlagi malonil-ACP
V naslednjem koraku so preverili ali ekspresija modulov na plazmidih z različnimi števili kopij: h-visoko število kopij, m-srednje in l-nizko št. kopij vpliva na končno količino proizvedenih MK. Najboljša kombinacija modulov na plazmidih z različnimi števili kopij je bila sledeča: mGLY-lACA-hFAS. Z ekspresijo GLY modula na plazmidu s srednjim št. kopij in FAS modula na plazmidu z visokim št. kopij so uspeli zmanjšati kopičenje za celico toksičnih intermediatov malonil-CoA in malonil-ACP. Manjša ekspresija ACA modula pa je bila še vedno zadostna za pretvorbo acetil-CoA do malonil-ACP. Rezultati na tej točki so pokazali, da je uravnoteženje prekurzorjev metaboličnih poti učinkovit pristop za povišanje potenciala celične proizvodnje MK v E. coli. Dosežena skupna proizvodnja je tako znašala 1,42g/L MK.
Izboljšanje stopnje prevajanja obeh GLY in FAS modulov je privedlo še do nadaljnjega izboljšanja uravnoteženosti med oskrbo z malonil-CoA in porabo malonil-ACP v proučevanem ekspresijskem sistemu mGLY-lACA-hFAS. Iz MIT Registra standardnih bioloških delov so izbrali 4 različne RBS 29-32, s katerimi so zamenjali 5'-UTR regijo (5'-neprevedeno regijo) nativnega T7 promotorja. Za testiranje funkcionalnosti konstruiranih RBS variant so kot reporter uporabili zeleni fluorescenčni protein in stopnjo spremembe fluorescence normalizirali na gostoto celic za karakterizacijo aktivnosti RBS. S kombinacijo nativnega RBS – relativna moč 3, RBS29 – moč 2 in RBS32 – moč 1 in modulov GLY in FAS so konstruirali 9 sevov. Ugotovili so, da najboljše lastnosti izkazuje sev rbs29-mGLY-lACA-hFAS (2,04 g/L MK), saj se je proizvodnja MK glede na materinski sev mGLY-lACA-hFAS (1,42 g/L MK) povečala za 46%.
Proizvodnja maščobnih kislin v nadzorovanih pogojih gojenja
Na koncu so testirali proizvodnjo MK optimiziranega seva rbs29-mGLY-lACA-hFAS še v 20 litrski šaržnem fermentorju z dohranjevanjem (delovni volumen 15 L). S kontrolo pH in dovajanjem glukoze so začeli, ko je bila začetno dodana 2% glukoza že skoraj izčrpana, raztopljen kisik pa se je močno povečal. Dovajanje glukoze je bilo omejeno na konstantni pretok 1,235 mL/min (0,494 g glukoze na minuto). S tem so zmanjšali izločanje toksičnega stranskega produkta ocetne kisline. Po 8h gojenja so dodali tudi 0,65 mM IPTG in tako inducirali prepisovanje genov s T7 RNA polimerazo ter sintezo rekombinantnih encimov zasnovane metabolične poti. Kot zanimivost so opazili, da so celice ob dodatku IPTG začele rasti diauksično. V tem primeru predvidevajo, da je do takšne rasti verjetno prišlo zaradi prilagoditve metabolizma na povišano sintezo rekombinantnih proteinov, zaradi česa se je rast upočasnila in energija prenesla v prid sinteze proteinov. Po 20-45h adaptacije, so celice začele ponovno rasti in porabljati glukozo in kisik. Fermentacijo so prekinili po 70h gojenja, ko so porabili vseh 4,5 L 40% glukoze. Po koncu gojenja je tako pripravljen sev BL21∆fadD, z vstavljenimi vektorji pCDM4-[RBS29]-mGLY, pACM4-lACA in pETM6-hFAS, proizvedel 8,6 g/L maščobnih kislin iz 110 g/L glukoze. Maksimalna suha celična gostota je bila 40,86 g/L DCW, optična gostota pa 90,8. Produktivnost proizvodnje je znašala 0,124 g/L MK, kar je najvišja produktivnost in proizvodni titer maščobnih kislin v E. coli do sedaj (oz. do izzida članka).
Zaključek
Tako pridobljen visok izkoristek maščobnih kislin bi lahko uporabili kot obetaven vir biogoriva in zagotovili tudi ekonomsko izvedljiv postopek za pridelavo goriv na osnovi maščobnih kislin. Poleg tega pa bi lahko modularne strategije, uporabljene v tej študiji, neposredno uporabili tudi za mikrobno proizvodnjo drugih industrijsko pomembnih metabolitov, ki izhajajo iz malonil-CoA in acetil-CoA.
Viri
1. Xu P., Gu Q., Wang W., Wong L., Bower A. G. W., Collins C. H., & Koffas M. A. G. (2013). Modular optimization of multi-gene pathways for fatty acids production in E. coli. Nature Communications, 4(1)
2. Marella E. R., Holkenbrink C., Siewers V., & Borodina I. (2018). Engineering microbial fatty acid metabolism for biofuels and biochemicals. Current Opinion in Biotechnology, 50, 39–46
3. Datsenko K. A., & Wanner B. L. (2000). One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences, 97(12), 6640–6645
4. Xu, P., Ranganathan, S., Fowler, Z. L., Maranas, C. D., & Koffas, M. A. G. (2011). Genome-scale metabolic network modeling results in minimal interventions that cooperatively force carbon flux towards malonyl-CoA. Metabolic Engineering, 13(5), 578–587
5. Xu P., Vansiri A., Bhan N., & Koffas M. A. G. (2012). ePathBrick: A Synthetic Biology Platform for Engineering Metabolic Pathways in E. coli. ACS Synthetic Biology, 1(7), 256–266
