Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi C. reinhardtii

Izhodiščni članek: Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo Toolkit Enabling Synthetic Biology in the Microalga Chlamydomonas reinhardtii. ASC Synthetic Biology, 2018

Uvod

Zaradi zmanjševanja zalog fosilnih goriv in zaradi toplogrednih plinov, ki se kopičijo kot posledica njihove porabe, postaja razogljičenje svetovnega gospodarstva vedno bolj nujno. Ena od možnosti je uporaba fotosintetskih mikroorganizmov, kot npr. mikroalge, za potencialno sintezo prekurzorjev biogoriva iz atmosferskega ogljikovega dioksida v procesu, za katerega bi porabljale sončno energijo. Zelena mikroalga Chlamydomonas reinhardtii je vrsta, ki se pogosto uporablja v biotehnologiji in bioinženiringu, saj je so vsi njeni genomi (jedrni in organelni) že posekvencirani in anotirani, molekularnobiološke tehnike in pogoji za gojenje v kulturi so visoko razviti, njena fiziologija in metabolizem pa sta dobro raziskana. Deli, razviti za MoClo, se lahko uporabljajo tudi v številnih drugih vrstah mikroalg, saj so transkripcijske enote Chlamydomonas primerne za številne gostitelje, med katerimi so nekateri tudi industrijsko pomembni <ref name="prvi"> Crozet, P. et al. "Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo Toolkit Enabling Synthetic Biology in the Microalga Chlamydomonas reinhardtii" ASC Synthetic Biology (Washington, D.C.) Vol. 7(9) (2018): 2074-2086 </ref>.

Organizme je enostavneje bioinženirsko modificirati z uporabo in sestavljanjem standardiziranih delov, saj to olajša gradnjo sintetičnih molekul DNA. Med razpoložljivimi standardi je MoClo tehnologija, ki obstaja od leta 2011 in je hierarhična nadgradnja molekulske klonirne tehnologije Golden Gate, osnovane na restrikcijskih encimih tipa IIS in DNA ligazi T4. Bazira na tvorbi standardizirane knjižnice osnovnih biokock, ki jih modificira tako, da se čimbolj prilegajo gostitelju in se jih združuje v višje enote v želenem vrstnem redu. MoClo kompleti so bili predhodno že razviti za številne modelne organizme, a ne še za mikroalge. Orodni komplet MoClo, predstavljen v članku, je sestavljen iz več kot 100 genetskih delov, ki so kodonsko optimizirani za jedrni genom Chlamydomonas <ref name="prvi"> </ref>, <ref name="drugi"> Weber, E. et al. "A Modular Cloning System for Standardized Assembly of Multigene Constructs". PLoS ONE (San Francisco) Vol. 6(2) (2011): e16765 </ref>.

Standard in vsebina kompleta MoClo

Sintaksa kompleta je definirana za plazmide najnižje stopnje, 0, ki vsebujejo standardne genetske dele (module stopnje 0) in jim pripisujejo fuzijska mesta za 10 klonirnih pozicij. V enem koraku lahko te standardizirane dele združimo v samostojne transkripcijske enote, module stopnje 1 in večgenske konstrukte, ki so stopnje 2 <ref name="prvi"> </ref>, <ref name="drugi"> </ref>.

V članku predstavljen komplet MoClo je sestavljen iz 119 delov, ki vključujejo 67 standardnih genetskih elementov, ki so na voljo na različnih mestih znotraj standarda. Večina standardnih genetskih elementov v kompletu je bilo razvitih za Chlamydomonas, a so jih avtorji članka dodatno modificirali tako, da so restrikcijski mesti BpiI in BsaI odstranili iz genoma z uporabo DNA sinteze ali mutageneze s PCR (vedno se ju znebimo na ničti ravni kloniranja). Genetski deli, ki so na voljo, zajemajo 7 promotorjev, ki so lahko s svojimi genetskimi elementi sklopljeni ali pa ne <ref name="prvi"> </ref>.

Prva raven kloniranja je združevanje modulov v transkripcijsko enoto. Kot selekcijske markerje so uporabili pet genov za rezistenco na antibiotik, ki lahko funkcionirajo tudi kot reporterski geni. V raziskavi, opisani v članku, so združili module, ki omogočajo kontrolo ekspresije gena za rezistenco na spektinomicin, aadA, s konstitutivnimi promotorji P_PSAD in P_βTUB2 z ali brez prvega introna βTUB2. Učinkovitost transformacije treh modulov v celicah UVM4 je bila ocenjena s štetjem kolonij, ki so zrasle na gojišču s streptomicinom. Prisotnost introna βTUB2 je močno povečala učinkovitost transformacije <ref name="prvi"> </ref>, <ref name="drugi"> </ref>.

Alternativni reporterji so bioluminiscentni protein. Komplet vsebuje luciferazo iz Gaussie princeps (zelo svetla) in modificirano Nanoluciferazo (NanoLuc), ki omogoča stabilen in močan signal. Luciferazo so klonirali na 6 različnih mest v standardu <ref name="prvi"> </ref>.

Ta na novo ustvarjen del je bil najprej testiran z najširše uporabljano kombinacijo promotorja in terminatorja (P_AR in T_RBC52) za močno konstitutivno izražanje v Chlamydomonas. Odgovarjajoči modul je bil združen z drugim modulom, kar je dodalo še rezistenco na paromomicin v napravo, ki so jo uvedli v genom seva D66. Med kolonijami, rezistentnimi na paromomicin je bilo pribl. 35% luminiscentnih. Nasprotno je bil med kolonijami, ki so bile rezistentne samo na paromomicin (transformante, ki niso izražale luciferaze) oz. pri sevu D66 signal precej šibkejši <ref name="prvi"> </ref>.

Nazadnje so primerjali moči terminatorjev in promotorjev. Združili so 4 module, kjer je bilo izražanje NanoLuc regulirano prek vseh možnih kombinacij dveh najpogostejših konstitutivnih promotorjev (P_AR in P_PSAD) in terminatorjev (T_RBCS2 in T_PSAD). Vsak modul je bil združen z modulom za rezistenco na paromomicin in vstavljen v genom Chlamydomonas. Stopnja bioluminiscence so bile ugotovljene iz stotin transformant za razlago efekta pozicije genoma. Moči obeh promotorjev sta bili primerljivi, medtem ko je bilo ugotovljeno, da je T_PSAD približno 10x močnejši od drugega terminatorja <ref name="prvi"> </ref>.

Kontrola izražanja genov

Za natančno uskladitev izražanja genov so bili v MoClo implementirani številni deli, ki to omogočajo.

Aktivnost promotorja P_NIT1 se npr. lahko kontrolira tako, da odstranimo vir dušika, saj je ta promotor močno negativno reguliran s strani amonijaka in močno aktiviran s strani nitrata. Modul, kjer P_NIT1 kontrolira ekspresijo gena ble-GFP je izkazal močno rezistenco na zeocin v sevu CC-1690 ampak le takrat, ko je bil amonijak kot vir dušika nadomeščen z nitratom. Nasprotno je promotor P_PSAD izkazoval močno rezistenco na zeocin pri obeh virih dušika. Promotor P_METE45 je omogočal pogojno funkcijsko komplementacijo fotosintetskega mutanta nac2-26, ki ne vsebuje fotosistema II zaradi odsotnosti TPR podobnemu proteinu NAC2, ki je potreben za stabilnost psbD mRNA, ki kodira protein reakcijskega centra D2. Celice z mutacijo v genu nac2-26, modificirane z modulom, ki vsebuje kodirajoče zaporedje za protein NAC2 pod kontrolo promotorja P_METE bi lahko rasle fotoavtotrofno in odsotnosti vitamina B12, vendar se jim v gojišče vseeno dodaja nizke koncentracije tega vitamina <ref name="prvi"> </ref>.

Regulacijo izražanja genov lahko kontrolira tudi vitamin B1 (tiamin) na ravni transkriptov s pomočjo RNA stikal. Vezava tiamin fosfata na RNA stikalo THI4 rezultira v alternativnem izrezovanju in zadrževanju odprtega bralnega okvirja 81 bp navzgor od mesta transkripcije, kar interferira s translacijo. RNA stikalo se odzove tudi, ko celice gojimo v prisotnosti intermediata pri biosintezi tiamina HET, ne pa tudi HMP, prav tako intermediata v biosintezni poti tiamina. To nakazuje na efektivno zaviranje transgena s pomočjo RNA stikala THI4 <ref name="prvi"> </ref>.

Modul, ki združuje P_AR in RNA stikalo THI4 torej omogoča ekspresijo gena ble-GFP in pogojno rezistenco na zeocin v sevu UVM4 <ref name="prvi"> </ref>.

Da je bilo omogočeno zaviranje izražanja genov, so ponovno dizajnirali prekurzorsko zaporedje mikroRNA, ki izhaja iz pre-miR1157 in se ga uporablja za sintezo umetnih miRNA tako, da je bilo kompatibilno s klonirno metodo Golden Gate. Da so pokazali njegovo uspešnost v represiji izražanja genov, so v mikroRNA prekurzor vnesli specifično umetno miRNA zaporedje (amiRNA), ki je usmerjeno proti genu MAA7, katerega zaviranje omogoča rezistenco na 5'-fluoroindol (5'-FI). Naključno kontrolno zaporedje amiRNA so vnesli v ogrodje. Te dele so nato vnesli pod kontrolo P_PSAD in T_PSAD in jih združili z modulom za rezistenco na paromomicin. Ista zaporedja amiRNA so vnesli tudi v vektor pChlamiRNA3 kot kontrolo. Po transformaciji seva CC-1690, je 36% celic, rezistentnih na paromomicin izkazovalo rezistenco na 5'-FI z napravo, katere tarča je bila MAA7, vendar ne skupaj z amiRNA. Modificirana 5'-RACE je pokazala, da je transkript gena MAA7 najpogosteje rezan na mestih, ki odgovarjajo pozicijama 10 in 11 amiRNA, kar je pričakovano za specifično aktivnost miRNA. Lastnosti delov, ki jih je mogoče kontrolirati, so lahko prav tako kombinirane, kot je prikazano za kontrolo od amiRNA odvisnega izražanja genov s strani P_NIT1. Strategija z amiRNA se je izkazala za uspešno za metabolno inženirstvo prekurzorja biogoriva v Chlamydomonas <ref name="prvi"> </ref>

Multipli fuzijski označevalci za detekcijo in čiščenje genskih produktov

Komplet MoClo vsebuje številne epitope in afinitetne označevalce. V raziskavi so uporabili mutanto rap2, neobčutljivo na rapamicin, da bi testirali funkcionalnost petih označevalcev. Dizajnirali so 5 naprav, ki so omogočale močno konstitutivno ekspresijo na N- in C-koncu označenega FKBP12, sklopljenega s paramicinskim modulom. Modificirani sevi so bili izbrani na gojišču s paromomicinom in funkcionalnost fuzijskega proteina je bila testirana z oceno občutljivosti na rapamicin. Proteinski ekstrakti so bili detektirani z imunološkim prenosom z uporabo za FKBP12 specifičnih in za označevalec specifičnih protiteles. Vsi označevalci so omogočali detekcijo ali čiščenje proteina FKBP12, kljub temu, da nekateri niso bili funkcionalni za obnovo občutljivosti na rapamicin. Test je pokazal, da je pCMM-9 učinkovitejši kot druge naprave, saj omogoča fenotip, identičen divjemu tipu in stopnjo ekspresije, ki je značilna za močan in specifičen Myc signal brez kakega opaznega procesiranja proteina <ref name="prvi"> </ref>.

Vizualizacija in targetiranje proteinov v živih celicah

Fluorescenčne proteinske oznake omogočajo časovno in prostorsko spremljanje dinamičnih ekspresijskih vzorcev na celičnem in subceličnem nivoju. Komplet MoClo za Chlamydomonas vključuje enajst peptidov za targetiranje in signaliziranje, ki omogočajo targetiranje fuzijskih proteinov v mitohondrijih, kloroplastih, jedru, sekretornih poteh, ER in peroksisomom podobnih mikrotelescih. Testirana je bila funkcionalnost teh peptidov in petih fluorescenčnih proteinov (rumenega, dveh rdečih, zelenega in ciano), ki so vključeni v komplet. Osem modulov, ki so vključevali različne fluorescenčne proteine in tarčna zaporedja je bilo združenih v naprave z modulom za rezistenco na antibiotik. Vse naprave so se obnašale kot predvideno in oddajale fluorescenčni signal v tarčnem kompartmentu <ref name="prvi"> </ref>.

Viri

<references/>