Multipleksna detekcija na zdravila odporne tuberkuloze z binarnimi deoksiribocimnimi senzorji

Multiplex detection of extensively drug resistant tuberculosis using binary deoxyribozyme sensors <ref>Bengston, H. N., Homolka, S., Niemann, S., Reis, A. J., da Sliva, P. E., Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M., Rohde, K. H. Multiplex detection of extensively drug resistant tuberculosis using binary deoxyribozyme sensors. Biosensors and Bioelectronics, 2017, 94, str. 176-183.</ref>

Tuberkulozo povzroča Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Po podatkih WHO iz leta 2015 sodi tuberkuloza med 10 najpogostejših vzrokov smrti. Leta 2015 je bilo diagnosticiranih 480.000 novih primerov multirezistentne oblike tuberkuloze.<ref>WHO Tuberculosis</ref>

Rezistentni sevi tuberkuloze so odporni na antibiotike prve linije (rifampin, isoniazid), zato je potrebno paciente zdraviti z antibiotiki druge linije, ki so dražji in manj učinkoviti. Sevi, ki so dodatno odporni na fluorokinolone in eno od intravenoznih zdravil (amikacin, kapreomicin, kanamicin), se smatrajo za obsežno odporne. Odpornost se pojavi zaradi polimorfizmov enega nukleotida (SNP) – zamenjava nukleotida v nekem genu vodi do zmanjšane učinkovitosti antibiotikov. Pri Mtb se take mutacije najpogosteje pojavljajo v genih rpoB, katG, inhA in gyrA.

Rutinsko uporabljene diagnostične metode, kot sta mikroskopija razmaza sputuma in kultivacija, imajo slabo občutljivost ali pa so dolgotrajne in potrebujejo dobro opremljene laboratorije. Razvoj testov pomnoževanja nukleinskih kislin je omogočil hitrejše zaznavanje Mtb in preverjanje občutljivosti na zdravila.

Nova metoda za hkratno detekcijo Mycobacterium tuberculosis in rezistence

DNA bakterij v kliničnem izolatu se najprej pomnoži z multipleksnim PCR (mPCR) - pomnožijo se samo posamezni segmenti petih genov: 23S rRNA za identifikacijo Mtb in segmenti genov rpoB, katG, inhA, gyrA, kjer se nahaja večina SNP-jev, povezanih z rezistenco na antibiotike. Prisotnost posameznih amplikonov (ki imajo lahko mutirano zaporedje – mt, ali zaporedje divjega tipa – wt), se potrdi z uporabo selektivnih in specifičnih binarnih deoksiribocimnih senzorjev (BiDz). Senzorji so sestavljeni iz 2 različnih ssDNA verig (Dza in Dzb), vsaka vsebuje vezavno zaporedje za substrat in polovico deoksiribocimnega katalitskega jedra. Če pride do hibridizacije obeh verig s tarčnim zaporedjem, se med obema senzorjema tvori katalitsko jedro, ki cepi substrat s fluoroforjem in dušilcem fluorescence, zaradi česar se poveča fluorescenca vzorca.

Metoda ima mnoge prednosti: uporablja univerzalen substrat; meja zaznave je zaradi katalitske cepitve substrata nizka; razločevati je mogoče med analiti, ki se razlikujejo v enem samem nukleotidu. Zato predstavlja točno in poceni osnovo za detekcijo in analizo multirezistentnih oblik Mtb.

Rezultati in razprava

BiDz senzorji za začetno optimizacijo so bili zasnovani z različnimi dolžinami Dza in Dzb verig, prav tako so imeli različne lokacije SNP-jev (torej so se vezali na različna mesta na DNA). Izbrani so bili senzorji, ki so selektivno zaznali samo en možen SNP, hkrati pa so imeli visoko občutljivost (podana kot razmerje signal/ozadje).

Izbranih je bilo 11 BiDz senzorjev, komplementarnih wt in mt zaporedjem Mtb. Le-te so uporabili za analizo z mPCR pomnoženih vzorcev divjega tipa Mtb in kliničnih izolatov, ki so imeli različne vzorce mutacij, povezanih z rezistenco. Vsak senzorji je specifično zaznali le prisotnost specifičnega tarčnega amplikona, občutljivost (razmerje signal/ozadje) pa je bila velika le v primeru specifične detekcije.

Z optimizacijo samega eksperimenta so ugotovili, da je najbolj ugoden čas inkubacije vzorca s senzorji 45 minut. V tem času se fluorescenca zaradi katalitske reakcije dovolj ojača, da jo je mogoče zanesljivo izmeriti, hkrati pa je eksperiment dovolj kratek, da omogoča ambulantno diagnostiko. Z metodo bi bilo mogoče zaznati tudi mešane okužbe. To so okužbe, pri katerih je v veliki populaciji na antibiotike občutljivih bakterij, majhen delež rezistentnih. Z modelnim eksperimentom, kjer so v vzorcu imeli le 10-odstotkov amplikonov rezistentnega seva, so uspeli pokazati uspešno specifično in občutljivo detekcijo SNP, povezanih z odpornostjo.

Modelni eksperiment je potrdil tudi možnost uporabe kombinatornega pristopa. V tem primeru bi se uporabila univerzalna Dza veriga v kombinaciji z več Dzb senzorji, ki bi bili zasnovani tako, da bi ločevali med različnimi nukleotidi, ki se lahko pojavijo pri posamezni mutaciji (SNP).

Pomen metode

Opisana metoda je zaradi uporabe univerzalnega substrata in enostavnih oligonukleotidnih BiDz senzorjev poceni in zelo prilagodljiva. Zato predstavlja hitro alternativo za diagnosticiranje tuberkuloze in ugotavljanje odpornosti na zdravila in bi se kot taka lahko uporabljala za ambulantno diagnostiko. Nadomestitev PCR iz izotermnim pomnoževanjem in uporaba kromogenih substratov bi še dodatno olajšala ambulantno uporabo testa. Zaradi prilagodljivosti in enostavne zasnove senzorjev, bi se spremenjena metoda lahko uporabljala tudi za diagnosticiranje drugih okužb ali raka.

Viri

<references/>

Pojdi nazaj na MBT seminarji 2017.